雛雞沙門(mén)氏菌病的生化鑒定與綜合防治

李亞妮 李培峰

摘 ?要：采集平定縣某自然發(fā)病雞場(chǎng)15只病死雛雞病料，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、病理組織學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、平板凝集試驗(yàn)，確診為雞白痢沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌兩種血清型混合感染所致。利用紙片法藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示6株沙門(mén)氏菌的高敏藥物有6種，分別是頭孢呋肟、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素。使用頭孢呋肟對(duì)群體進(jìn)行治療，雞群病情明顯改善。

關(guān)鍵詞：沙門(mén)氏菌;生化鑒定; 藥敏試驗(yàn);綜合防治

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.314.4+3 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）03-0009-05

雞沙門(mén)氏菌是由沙門(mén)氏菌屬中一個(gè)或多個(gè)成員所引起的雞急性或慢性傳染病[1]，引起禽類(lèi)發(fā)病的沙門(mén)氏菌主要有雞白痢沙菌、雞傷寒沙門(mén)氏菌及有鞭毛能運(yùn)動(dòng)的多種副傷寒沙門(mén)氏菌[2]，一直是危害養(yǎng)雞生產(chǎn)的最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病之一，沙門(mén)氏菌具有致病性強(qiáng)、垂直傳播等特點(diǎn)，而且由于抗菌藥物的濫用，沙門(mén)氏菌的耐藥譜也越來(lái)越廣，一旦感染，防治困難較大，可給種雞及蛋雞生產(chǎn)帶來(lái)極大損失[2，3]。目前我國(guó)一些規(guī)模較大的種禽場(chǎng)對(duì)雞白痢已經(jīng)實(shí)施了比較嚴(yán)格的凈化措施，但仍有相當(dāng)一部分雞飼養(yǎng)者為小規(guī)模養(yǎng)殖，缺乏雞白痢的凈化意識(shí)，舍不得投入，該病的危害仍然比較嚴(yán)重。陳自望等1999、2003、2004年對(duì)福州市部分父母代種雞場(chǎng)進(jìn)行了雞白痢桿菌病的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3年的平均陽(yáng)性率分別為18.8%、30.7%、70.9%，陽(yáng)性率逐年呈上升趨勢(shì)，且陽(yáng)性率很高[4]。

雞沙門(mén)氏菌病的發(fā)生與傳播的主要階段是在育雛的早期。因此，必須重視育雛期的環(huán)境控制，進(jìn)行合理消毒，防止水平傳播的發(fā)生。吳斌等[5]從進(jìn)口的213份樣品中，共發(fā)現(xiàn)了13株沙門(mén)氏菌，其中魚(yú)粉中占4.69%（3/64），肉骨粉中占9.43%（10/106）。可見(jiàn)，飼料中的沙門(mén)氏菌也直接威脅著飼用雞只的健康。

為了減輕由此造成的死亡和損失，許多雞場(chǎng)都積極地用藥物進(jìn)行本病的防治。焦新安等對(duì)我國(guó)部分地區(qū)1962～1999年間346株雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行了藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果表明，在近40年時(shí)間里，雞白痢沙門(mén)氏菌對(duì)氨芐青霉素、壯觀霉素、復(fù)方磺胺、磺胺異惡性唑、甲氧芐胺嘧啶、羧芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素、青霉素的耐藥率顯著增強(qiáng)，菌株的多重耐藥率明顯增加[6]。為提高療效，研究表明用藥敏試驗(yàn)的方法確定敏感藥物后再組方進(jìn)行治療，療效顯著。

近年來(lái)山西地區(qū)發(fā)生的雛雞感染沙門(mén)氏菌損失嚴(yán)重，廣大養(yǎng)殖戶(hù)缺乏必要的診斷手段，影響了治療進(jìn)程。我們旨在通過(guò)實(shí)驗(yàn)室手段，進(jìn)一步明晰該病的病原情況，采取有效的用藥措施，既解決了廣大養(yǎng)殖戶(hù)的燃眉之急，也完善該病的綜合防治措施理論，從而達(dá)到減低發(fā)病或達(dá)到凈化效果，促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?被檢材料 ?15只病死雛雞均取自平定某自然發(fā)病雞場(chǎng)。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂、S.S.瓊脂、鮮血瓊脂培養(yǎng)基（購(gòu)于杭州天和生物制品有限公司）。

1.1.3 ?主要試劑 ?沙門(mén)氏菌屬診斷血清（購(gòu)于杭州天和生物制品有限公司）、微量糖發(fā)酵管及抗生素藥敏紙片（購(gòu)于杭州天和生物制品有限公司）。

1.1.4 ?試驗(yàn)動(dòng)物 ?由平定縣某種雞場(chǎng)提供5日齡雛雞共120只。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細(xì)菌形態(tài)及運(yùn)動(dòng)力觀察 ?病料直接涂片后染色鏡檢;選取可疑菌落涂片染色、鏡檢。并對(duì)不同菌株進(jìn)行懸滴運(yùn)動(dòng)力檢查[7]，全部25塊病料涂片檢查，用革蘭氏染色法染色后鏡檢。

1.2.2 ?分離培養(yǎng)[8] ?無(wú)菌取肝脾組織，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂和S.S.瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落特征。將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種三糖鐵（TSI）瓊脂，37℃培養(yǎng)24h。

1.2.3 ?病理組織學(xué)觀察 ?取具有眼觀病變的肝、脾、腎、心臟、卵巢及腫瘤組織，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，H.E染色，病理組織學(xué)檢查。

1.2.4 ?動(dòng)物回歸試驗(yàn) ?用分離到的純化的病菌按107～1010稀釋后采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板散布法做活菌計(jì)數(shù)計(jì)算每毫升的平均活菌量，把細(xì)菌用生理鹽水稀釋成10×109cfu/ml的懸液。取60只飼養(yǎng)到5日齡的肉雛雞分為兩組，每組30只，試驗(yàn)組肉雛雞口服菌液2ml/只，對(duì)照組肉雛雞口服生理鹽水2ml/只。分開(kāi)飼養(yǎng)觀察發(fā)病和死亡癥狀，連續(xù)觀察7d記錄結(jié)果，取死亡雞只無(wú)菌采集心、肝、肺劃線(xiàn)接種于S·S瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，取典型的紅色菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h做好標(biāo)記，放4℃冰箱保存?zhèn)溆茫偃?0只5日齡的肉雛雞重復(fù)以上試驗(yàn)，對(duì)比兩次試驗(yàn)的結(jié)果。

1.2.5 ?生化試驗(yàn) ?取已分離純化的菌株和兩次動(dòng)物回歸試驗(yàn)的菌株用VITEX32全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行分析鑒定。

1.2.6 ?平板凝集試驗(yàn) ?取這三種菌液各50μl與等量的雞沙門(mén)氏菌多價(jià)陽(yáng)性血清做平板凝集試驗(yàn)，呈現(xiàn)顆粒凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)。隨機(jī)抽檢100只晉中某自然發(fā)病種雞場(chǎng)的種雞，采集血清用標(biāo)準(zhǔn)雞沙門(mén)氏菌抗原進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，呈現(xiàn)顆粒凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)。計(jì)算其陽(yáng)性率。

1.2.7 ?藥物敏感性試驗(yàn) ?采用紙片擴(kuò)散法將純培養(yǎng)分離出的6株沙門(mén)氏菌菌液，用滅菌的接種環(huán)均勻致密劃線(xiàn)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基表面。用無(wú)菌鑷子夾取藥物紙片（杭州微生物試劑有限公司）貼在已接種的瓊脂平板培養(yǎng)基上，紙片要貼均勻，紙片與紙片中心距離不得小于24mm，每個(gè)平板上貼5張。紙片貼后不應(yīng)再移動(dòng)，因?yàn)橛行┧幬飼?huì)立即擴(kuò)散。貼上紙片15min內(nèi)把平板倒置放入保溫箱37℃下培養(yǎng)16～24h，檢查藥物紙片。

用游標(biāo)卡尺測(cè)量其抑菌圈環(huán)直徑，根據(jù)藥敏試驗(yàn)抑菌圈環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑≥15mm的為高敏， 10～15mm的為敏感，<10mm的為耐藥。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?形態(tài)特征和運(yùn)動(dòng)力 ?病料直接涂片，革蘭氏染色之后，油鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)少量革蘭氏陰性直桿菌;挑取S·S瓊脂平板上的單個(gè)菌落，涂片、火焰固定、革蘭氏染色、鏡檢可見(jiàn)紅色、著色均一、單個(gè)或成對(duì)的兩端渾圓的小直桿菌，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢。符合雞沙門(mén)氏菌特征。

2.2 ?培養(yǎng)特性 ?分離菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上呈圓形、微隆起、光滑、濕潤(rùn)、半透明或灰白色、邊緣整齊，直徑小于1mm的針尖大小“露珠狀”小菌落;在麥康凱瓊脂上長(zhǎng)出無(wú)色透明，直徑有1mm的圓形小菌落;在鮮血瓊脂上不溶血;在S.S瓊脂上形成中心黑色、邊緣灰白的透明小菌落;營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物呈均勻混濁，管底有少量沉淀物。三糖鐵斜面劃線(xiàn)培養(yǎng)，斜面上為紅色，底層穿刺培養(yǎng)，底層多數(shù)產(chǎn)生H2S為黑色，少數(shù)為黃色。

2.3 ?病理組織學(xué)觀查 ?從鏡檢肝組織內(nèi)見(jiàn)許多壞死灶，壞死灶內(nèi)充滿(mǎn)淋巴細(xì)胞、少量巨噬細(xì)胞和異嗜性白細(xì)胞，腸系膜見(jiàn)以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)締組織增生為主肉芽腫病變，腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)締組織增生，胰腺細(xì)胞壞死，偶有肉芽腫病變，見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

■

■

■

2.4 ?動(dòng)物回歸試驗(yàn) ?結(jié)果見(jiàn)表1。

■

兩次動(dòng)物回歸試驗(yàn)，試驗(yàn)組雞只發(fā)病癥狀及剖檢癥狀相似，同肉種雞場(chǎng)的病、死雞外表狀態(tài)及剖檢癥狀均一致，兩組分離的病原菌在S·S瓊脂平板上長(zhǎng)出細(xì)小、紅色、光滑濕潤(rùn)、圓形半透明大小為1mm的菌落。挑取S·S瓊脂平板上的單個(gè)菌落，涂片、革蘭氏染色、鏡檢，兩組分離的病原菌同接種的病原菌形態(tài)，大小相似。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際發(fā)病情況相一致。兩組試驗(yàn)的生理鹽水對(duì)照組均生長(zhǎng)良好，沒(méi)有發(fā)病雞只。

2.5 ?生化試驗(yàn) ?結(jié)果見(jiàn)表2。

將供試的22個(gè)菌株經(jīng)純培養(yǎng)后分別接種于下列發(fā)酵管中觀察結(jié)果如表1。

因多數(shù)雞白痢沙門(mén)氏菌不發(fā)酵麥芽糖和衛(wèi)矛醇。可確認(rèn)S1～S14菌株屬于沙門(mén)氏菌屬D群中的雞白痢沙門(mén)氏菌;S15～S22菌株屬于沙門(mén)氏菌屬D群中的雞傷寒沙門(mén)氏菌[9]。

2.6平板凝集試驗(yàn)結(jié)果 ?三株細(xì)菌與標(biāo)準(zhǔn)雞沙門(mén)氏菌多價(jià)陽(yáng)性血清均發(fā)生顆粒凝集反應(yīng)，平板凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性，證明這三株細(xì)菌為雞沙門(mén)氏菌。

種雞平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性率為15%，證明本種雞場(chǎng)雞沙門(mén)氏菌未凈化干凈。

2.7 ?藥物敏感性試驗(yàn) ?從藥敏試驗(yàn)結(jié)果的整體看，所選的6株分離菌對(duì)供試的8種抗菌藥物的敏感性相似;同一血清型內(nèi)不同菌株的藥敏性表現(xiàn)基本一致，見(jiàn)表3。

由表3可知，6株沙門(mén)氏菌的高敏藥物有6種，分別是頭孢呋肟、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素，它們都可以作為臨床上有效的治療藥物。值得注意的是，隨著藥物在雞場(chǎng)使用年限的增加，沙門(mén)氏菌的耐藥程度也逐漸加強(qiáng)，而且出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象，這與相關(guān)報(bào)道是一致的[10]。因此對(duì)此病治療前應(yīng)做藥敏試驗(yàn)。

3 ?綜合防治

3.1 ?根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果用頭孢呋肟按治療量的1.5倍飲水治療，同時(shí)水中加腎腫解毒藥及速溶性多種維生素。病雞第二天開(kāi)始病情明顯改善，死亡雞只每天減少，到第7天雞只基本正常，沒(méi)有死亡雞只。

3.2 ?搞好飼養(yǎng)場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生消毒，發(fā)病期間用1%的苯酚每日消毒一次，連續(xù)5d，以后隔日一次。

3.3 ?控制雛雞的飼養(yǎng)密度和雞舍的保溫，同時(shí)要保障通風(fēng)換氣，提高飼養(yǎng)環(huán)境質(zhì)量。

3.4 ?做好各種疫病的預(yù)防和控制，用0.5%的過(guò)氧乙酸帶雞消毒，每3d進(jìn)行一次噴霧消毒，按照防疫程序及時(shí)接種疫苗。

4 ?小結(jié)與討論

4.1 ?本病的傳染源主要為病雞和帶菌雞。傳播途徑有水平傳播和垂直傳播，本雞場(chǎng)雛雞沙門(mén)氏菌病的這次爆發(fā)與種母雞的雞沙門(mén)氏菌病有很重要的關(guān)聯(lián)，本種雞場(chǎng)雞沙門(mén)氏菌病的陽(yáng)性檢出率為15%。帶菌公雞可通過(guò)精液將病原傳給母雞，母雞又可通過(guò)垂直傳播污染種蛋，所以雛雞就感染了雞沙門(mén)氏菌病，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)種雞的雞沙門(mén)氏菌凈化和對(duì)種蛋徹底進(jìn)行消毒，是控制該病發(fā)生的重要措施，對(duì)預(yù)防雛雞沙門(mén)氏菌尤為重要，雛雞用敏感藥物預(yù)防對(duì)本病有很好的控制作用。種雞雞沙門(mén)氏菌凈化：開(kāi)產(chǎn)前一次，產(chǎn)蛋高峰一次，350日齡再檢一次，可采用快速平板凝集法全群檢疫，淘汰陽(yáng)性雞只，可疑雞只隔離飼養(yǎng)，再進(jìn)行復(fù)檢，陽(yáng)性者淘汰。

從該雞場(chǎng)采集的病死雛雞病料，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、病理組織學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、平板凝集試驗(yàn)，確診為雞白痢沙門(mén)氏菌和雞傷寒沙門(mén)氏菌兩種血清型混合感染所致。試驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明該雞場(chǎng)受到雞沙門(mén)氏菌感染。利用紙片法藥敏試驗(yàn)，顯示頭孢呋肟、氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素對(duì)雞沙門(mén)氏菌具有高敏感性。對(duì)雞群使用頭孢呋肟1.5倍飲水治療，經(jīng)過(guò)7d的治療，雞群基本正常，無(wú)死亡雞只。

4.2 ?堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，如確需引進(jìn)，需對(duì)引進(jìn)雞場(chǎng)進(jìn)行雞沙門(mén)氏菌檢測(cè)咨詢(xún)，確定為無(wú)雞沙門(mén)氏菌病雞群，方可引進(jìn)。

4.3 ?對(duì)孵化種蛋進(jìn)行全出全進(jìn)制，對(duì)種蛋進(jìn)行嚴(yán)格的熏蒸消毒，每次出完雛雞以后，對(duì)孵化器進(jìn)行徹底消毒，以便殺滅環(huán)境中的細(xì)菌。

4.4 ?各種應(yīng)激因素：如飼養(yǎng)密度大、通風(fēng)不良、舍內(nèi)溫度過(guò)高或過(guò)低、衛(wèi)生條件不良、飼養(yǎng)管理不善都可誘發(fā)雞只發(fā)病，應(yīng)減少應(yīng)激因素，改善飼養(yǎng)管理，提高雛雞的營(yíng)養(yǎng)水平，加強(qiáng)雞只抵抗力。

4.5 ?對(duì)種雞和雛雞不要亂投藥，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感藥物防治雞沙門(mén)氏菌病，注意耐藥菌株的出現(xiàn)，要定期給種雞投藥，并對(duì)雞舍消毒，消除雞沙門(mén)氏菌帶菌污染，若一個(gè)種雞場(chǎng)雞沙門(mén)氏菌凈化后未進(jìn)行雞舍消毒，不出一個(gè)月必將導(dǎo)致雞沙門(mén)氏菌再次污染，重新檢測(cè)時(shí)雞沙門(mén)氏菌病陽(yáng)性率增高。在防治沙門(mén)氏菌上，抗生素起了很大作用，但也帶來(lái)很多的負(fù)面影響。它引起消化道正常菌群失調(diào)、產(chǎn)生耐藥菌株、抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)等，甚至給禽產(chǎn)品帶來(lái)藥物殘留。所以應(yīng)該把疾病抵御在雞場(chǎng)之外，最大限度地減少藥物的應(yīng)用。

4.6 ?要防止沙門(mén)氏菌病的發(fā)生，必須堅(jiān)持預(yù)防第一，把沙門(mén)氏菌的檢疫放到雞場(chǎng)的工作程序上來(lái)，建立檢疫淘汰制度和相應(yīng)的飼養(yǎng)管理凈化措施。同時(shí)要把好引種關(guān)，從雞白痢病凈化達(dá)標(biāo)場(chǎng)引種。種雞場(chǎng)更要把好種雞檢疫關(guān)，減少垂直傳播，減弱白痢感染者隨代次的后續(xù)擴(kuò)大效應(yīng)。

雞沙門(mén)氏菌對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的危害已越來(lái)越被人們所重視，非傷寒沙門(mén)氏菌病，是人與動(dòng)物腸道細(xì)菌病的主要病原[11]，目前在發(fā)達(dá)國(guó)家，沙門(mén)氏菌感染是報(bào)道最多的食源性細(xì)菌病之一[12]，雞沙門(mén)氏菌凈化工作勢(shì)在必行。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?吳清民主編.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.

[2] ?甘孟侯.中國(guó)禽病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999，136-137.

[3] ?焦新安，劉秀梵.禽沙門(mén)氏菌病流行現(xiàn)狀與控制對(duì)策[J].中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)報(bào)，1998，15（1）：23-24.

[4] ?陳自望，葉瑋. 福州市雞白痢桿菌病的血清學(xué)調(diào)查[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2006（5）：5-6.

[5] ?吳斌，陳明生，秦成，等.進(jìn)口飼料中沙門(mén)氏菌的分離與鑒定[J].飼料工業(yè)，2003，24 （11） 51-52.

[6] ?潘志明，焦新安，黃金林，等.雞沙門(mén)氏菌弱毒凍干苗的研制[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，4：3-4.

[7] ?姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：16-17.

[8] ?廖延雄.獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)診斷手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版，1995.

[9] ?RE布坎南，NE吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第8版）[M].北京：科學(xué)出版社，1981.392-442.

[10] ?蘇戰(zhàn)強(qiáng)， 單文魯， 王治才. 伊犁地區(qū)雛雞群沙門(mén)氏菌病的分離及病菌藥物敏感性的調(diào)查[J].畜禽業(yè)， 2005，12：14-15.

[11] ?Rabsch W，Tschpe H，Baumler AJ.Non-typhoidal salmonellosis：emerging problems[J].Microbes and Infection.2001，3：237-247.

[12] ?Anonymous.WHO Surveillance programme for control of food-borne infections and intoxications in Europe. 6th report，1990-1992[J].Federal Institute for Health Protection of Consumers and Veterinary Medicine，1995，Berlin.