深圳梧桐山毛棉杜鵑根內真菌的分離與鑒定

劉亞等

摘要[目的] 對深圳梧桐山毛棉杜鵑根內真菌進行分離、鑒定，為深圳梧桐山毛棉杜鵑優良菌株的篩選奠定基礎。[方法]采用根段直接培養法從毛棉杜鵑的根內分離得到14個菌株，采用rDNAITSPCR分子生物學方法對所得菌株進行鑒定。[結果]深圳梧桐山毛棉杜鵑根內真菌豐富，所獲的14個菌株均屬于子囊菌門（Ascomycota）；除瓶頭霉屬（Phialocephala）和軟盤菌屬（Mollisa）外，其余菌株分別與Bionectria ochroleuca、Gloeotinia temulenta、Aspergillus sydowii、Paecilomyces javanicus和Fusarium oxysporum同源或近緣，均首次在杜鵑花科植物根內發現。[結論]該研究為毛棉杜鵑菌根化育苗技術的優良菌株篩選研究奠定基礎。

關鍵詞毛棉杜鵑；根內真菌；菌落形態； rDNA ITS序列

中圖分類號S718.81文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）29-009-04

毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense）為杜鵑花科杜鵑屬馬銀花亞屬常綠灌木或小喬木，其花朵艷麗，花色豐富，具有較高的觀賞價值。深圳市梧桐山風景名勝區有較大面積的毛棉杜鵑天然林，盛花期整體景色壯麗，是該景區的特色景點。開展毛棉杜鵑資源的開發利用，不僅具有較高的經濟效益，也具有較高的社會效益和生態效益。

杜鵑花科植物為典型的菌根依賴型植物，能與真菌形成具有圈狀結構的菌根共生體，即杜鵑花菌根（Ericoid mycorrhiza）。不同種類的杜鵑花屬植物或不同生態環境的同種杜鵑花植物，其根內真菌的種類和組成具有較大差異性。筆者采用根段培養法，對深圳梧桐山野生毛棉杜鵑根內真菌進行分離與培養，并運用rDNAITSPCR分子生物學方法進行菌株鑒定，探討毛棉杜鵑菌根真菌多樣性，以期為毛棉杜鵑菌根化育苗技術的優良菌株篩選研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料梧桐山自然風景區位于廣東省深圳市東部，113°17′～114°18′E，22°23′～22°43′N。2014年3月下旬于梧桐山自然風景區采集一批毛棉杜鵑野生幼苗作根內真菌的分離研究。

1.2方法

1.2.1根內真菌的分離及培養。根內真菌分離培養基使用改良的馬丁-孟加拉紅培養基，菌株培養基使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。選取毛棉杜鵑健壯纖細的根系，在清水中洗凈泥土和雜質，瀝干水分。在超凈工作臺下先在75%乙醇中浸泡15 s，無菌水漂洗3～5次；再在0.1%升汞中浸泡1～2 s，無菌水漂洗3～5次。把根系剪成長約0.5 cm的小段，用無菌濾紙吸干水滴，每個平板5條根段，置于分離培養基中培養，共50個根段。用接種棒蘸取少量最后一遍漂洗根系的無菌水，均勻涂抹于平板，作為對照排除雜菌。把培養根段和對照的平板置于25 ℃培養箱中黑暗培養14～28 d。

待菌落從根段中長出，用接種針挑取菌絲至PDA培養基上，培養7 d后觀察菌落形態的一致性和均勻性。若菌落形態有差異，進行二次分離，如此反復直至純化。把純化后的菌株根據菌落形態特征進行描述記錄和分類整理，包括菌落直徑、顏色、質地、是否有液體分泌物、邊緣、菌落外形等。

1.2.2菌株分子生物學鑒定。

菌株DNA提取參考莊彩云等方法。PCR擴增采用真菌通用引物，ITS1F：5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′，ITS4B：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′。PCR擴增體系（25 μl）：2×MightyAmp Buffer Ver.2（Mg2+，dNTP plus）（TaKaRa）12.5 μl；引物各0.8 μl；DNA模板20 ng；MightyAmp DNA Polymerase（1.25 U/μl）（TaKaRa）0.5 μl；ddH2O定容至25 μl。PCR反應循環參數：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，38個循環；68 ℃延伸7 min。

ITS區段PCR擴增產物的檢測及測序：12 g/L PCR產物的Agarose在80 V電壓下電泳40 min，BIORAD凝膠成像系統檢測，若條帶清晰則樣品可用于測序。

PCR擴增產物測序由英濰捷基（上海）貿易有限公司完成。把得到的序列提交至GeneBank數據庫進行Blast相似性比對，下載相似度較高的序列，經過ClustalX軟件比對并校正后，采用MEGA6軟件的NeighborJoining程序構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1菌落形態

從野生毛棉杜鵑幼苗根內分離純化14個菌株，按照菌落的形態特征分為6類（表1）。接種于PDF培養基上，置于25 ℃培養箱中暗培養21 d后，生長最快的菌株菌落直徑可達8.0 cm，生長最慢的僅有0.8 cm；菌落顏色以灰色或深灰色為主，還有白色和黃色；質地多為絨氈狀，還有薄蠟質和銀耳狀；均沒有液體分泌物；少數菌落中間隆起。

43卷29期劉 亞等深圳梧桐山毛棉杜鵑根內真菌的分離與鑒定

2.2菌株ITS序列鑒定及系統發育分析

把測得的序列提交至GeneBank數據庫進行Blast相似性比對（表2）。下載相似度最高及較高的序列，以親緣關系相對較遠的Schizophyllum commune（GeneBank登錄號EF155505）為外群，構建NJ系統發育樹（圖1），14個菌株聚為11類。其中，菌株2、3、7、8與Mollisia聚在一起獲得99%的支持率，序列相似度均達到99%；菌株7、8與Mollisia cinerea的序列相似度均達到93%。菌株13和10與Phialocephala 具有99%的序列相似度，菌株13與P. fortinii菌株（GeneBank登錄號AB671499）的相似度為99%。菌株1和菌株4分別與GeneBank登錄號EU076958 菌株 （Uncultured Helotiales sp.） 和KF498574.1菌株 （Sordariomycetes sp.） 具有較高的相似度（表2）。

此外，菌株6、9、11、12和14分別與Bionectria ochroleuca、Gloeotinia temulenta、Paecilomyces javanicus、Fusarium oxysporum、Aspergillus sydowii等菌株聚在一起，序列相似度在99%以上，表明它們與對應菌株同源或為同一菌種。

3結論與討論

3.1結論

從深圳梧桐山毛棉杜鵑野生幼苗根段中分離得到14個內生真菌的菌株。依據菌落形態特征分為6類，菌落顏色以灰色或深灰色為主；基于rDNAITS序列分析和NJ系統發育樹，14個菌株聚為11類，均隸屬于子囊菌門，其中柔膜菌目菌株的數量（菌株2、3、7、8、13、10、4、9）最豐富，占菌株總數的57.1%。

3.2討論

3.2.1菌株數量和菌株類型數量。

張春英從浙江、湖南等4個樣地采集了24株云錦杜鵑（每個樣地分別采集6株，取200個根段），從800個根段中共分離培養得到280個菌株。應用菌落形態、菌絲體顯微特征和rDNAITS片段的RFLP圖譜分析，確定了14個RFLP類型和3個未能鑒定的類型。在14個RFLP類型中，有7個類型與現有的杜鵑花類菌根菌親緣關系密切，分別為Oidiodendron maius、Cryptosporiopsis ericae和5種尖苞樹科植物的內生真菌的同源或近緣種；2個類型為黑色有隔內生真菌，即Phialocephala類。楊兵采用與張春英的研究方法，從上海、杭州、寧波3個地區18株毛鵑的600個根段內，分離培養得到366個菌株，確定了19個RFLP類型，其中9個類型為尖苞樹科尖苞樹屬植物的內生真菌，另有8個未知的子囊菌和2個其他未知類型。劉振華從吉林、重慶、云南3個樣地的牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthum）、小杜鵑（Rhododendron）、越橘（Vaccinium）等9種共24株杜鵑中，分離培養得到500個菌株，利用菌落形態結合rDNAITS序列分析鑒定出3種杜鵑花類菌根真菌Oidiodendron maius、Meliniomyces variabilis、Cryptosporiopsis ericae，1種黑色有隔內生真菌Phialocephala fortinii和2種尖苞樹科植物內生真菌或其近緣種。

深圳梧桐山毛棉杜鵑自然群落中極少見到野生幼苗，采集的樣本較少，但在50個根段內分離得到14個菌株，經過ITS序列分析被歸為11類不同菌種的同源或近緣種。雖然采樣植株較少，菌株數量不多，但菌株類型較豐富，反映了梧桐山毛棉杜鵑根內真菌也具有較高的菌種多樣性。

3.2.2菌落形態分類和ITS分子分類結果的比較。

傳統的真菌鑒定方法依據菌落形態特征及菌體的光學顯微結構，但真菌形態結構復雜，而且不少菌種的菌落形態特征和生理生化指標在不同培養基上會發生變化。另一方面，大多數菌根真菌在培養過程中不產生孢子，更增加了菌種鑒定的困難。隨著GeneBank數據庫的建立和生物信息學的發展，應用rDNAITS序列分析進行真核生物的系統發育、分類鑒定和多樣性研究已成為一種有效且快速的方法。

其他學者對杜鵑花類菌根菌的研究也表明不同菌落形態的菌株的rDNA序列具有同源性。在該研究所獲得的14個菌株中，根據菌落形態特征和rDNA ITS序列分析分別劃分為6類和11類，所獲結果稍有差異。其中，同屬菌落形態C類的菌株1、10、13，在NJ系統發育樹上并未聚在一起，菌株1與菌株10和13的分支距離很遠。分別同屬菌落形態D類的菌株（菌株6、14）和菌落形態F類的菌株（菌株9、11、12），也在NJ系統發育樹上分離。然而，有些菌落形態類似的菌株，如菌株2、3、7、8，在rDNA序列上具有一致性，反映了它們是同一種或近緣種。由此可見，rDNAITS序列分析結果更可信。

3.2.3菌株鑒定。

目前國內外已有研究表明，從杜鵑花科植物中分離并回接確認為杜鵑花類菌根真菌的都屬于子囊菌類。該研究對毛棉杜鵑進行菌根分離得到的14個菌株均屬于子囊菌門，分別屬于柔膜菌目、肉座菌目、散囊菌目。其中菌株2、3、7、8與皮盤菌科軟盤菌屬Mollisia同源；菌株7和8與M. cinerea的序列相似度達93%，反映了它們具有較高的同源性。楊秀麗[11]和劉鳳紅等[12]分別在大興安嶺地區的杜香（杜鵑花科杜香屬）和長白山地區的篤斯越橘根內也分離得到同屬Mollisia minutella的同源菌株；劉仁陽等在梵凈山雷山杜鵑的根內也分離得到M. cinerea的同源菌株，反映了Mollisia屬菌種可與杜鵑花科植物形成菌根共生體。

該研究還分離獲得了2個與Phialocephala具有較高同源性的菌株，其中1個與P. fortinii具有99%的序列相似度（菌株13）。Phialocephala屬的真菌通常被歸為深色有隔內生真菌[13]。近年有關Phialocephala屬的真菌在杜鵑花科植物根內出現的研究已有報道，如楊秀麗[11]、劉鳳紅等[12]和劉振華[9]分別報道了Phialocephala屬同源或近緣真菌為大興安嶺地區和長白山地區杜鵑花科植物菌根菌的優勢種。

該研究未分離到Hymenoscyphus eircae、Oidiodendron sp.、Cryptosporiopsis ericae、Meliniomyces variabilis等典型的杜鵑花類菌根菌種。值得關注的是分離獲得的Bionectria ochroleuca、Gloeotinia temulenta、Aspergillus sydowii（聚多曲霉）、Paecilomyces javanicus（爪哇擬青霉菌）和Fusarium oxysporum（尖孢鐮刀菌）的同源或近緣種，均是首次在杜鵑花科植物根內出現。其中，Bionectria ochroleuca對多種植物病原菌具有拮抗作用[14-15]；Gloeotinia temulenta和Fusarium oxysporum通常為植物致病性真菌[16-18]；Paecilomyces javanicus為昆蟲天敵真菌[19]。該研究回接了2個曲霉菌株到毛棉杜鵑幼苗上，未見有致病性且具有促生作用（另文報道），它們與毛棉杜鵑的生態關系還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 劉振華，姚娜，楊凱，等.樹楓杜鵑菌根真菌分離與鑒定[J].林業科學研究，2012，25（6）：795-797.

[2] 劉仁陽，歐靜，李冠楠，等.梵凈山雷山杜鵑根部真菌分離與鑒定[J].西北農業學報，2014，23（4）：178-185.

[3] 徐勝男，王濟，張凌云，等.馬纓杜鵑菌根真菌的種類組成[J].貴州農業科學，2014，42（6）：76-78，79.

[4] 張春英，尹麗娟，王胤，等.一種簡捷的分離杜鵑花類菌根真菌的方法[J].生物技術，2007，37（6）：28-32.

[5] 莊彩云，李潞濱，胡陶，等.適用于rDNA ITS分析的蘭屬菌根真菌培養及DNA提取方法[J].北京農學院學報， 2007，22（3）：4-6.

[6] GARDES G M，BRUNS T D.ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes application to the identification of mycorrhizae and rusts[J].Molecular ecology，1993，2（2）：113-118.

[7] 張春英.云錦杜鵑菌根及其菌根真菌多樣性研究[D].北京：北京林業大學，2008.

[8] 楊兵.毛鵑菌根真菌多樣性初步研究[D].鄭州：河南農業大學，2010.

[9] 劉振華.杜鵑花菌根真菌分離鑒定及多樣性分析[D].北京：中國林業科學研究院，2010.

[10] 楊秀麗，閆偉.篤斯越橘菌根真菌多樣性[J].微生物學報，2015，55（2）：214-219.

[11] 楊秀麗.大興安嶺興安落葉松森林生態系統菌根及其真菌多樣性研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2010.

[12] 劉鳳紅，程顯好，顧亮，等.長白山野生篤斯越橘根系內生菌資源調查[J].山東農業科學，2015，47（1）：41-46.

[13] 劉茂軍，張興濤，趙之偉.深色有隔內生真菌（DSE）研究進展[J].菌物學報，2009，28（6）：888-894.

[14] 劉琴英，蔣冬花，齊育平，等.淡色生赤殼菌Bo-1菌株拮抗物質的分離純化、解析及活性分析[J].植物保護學報，2014，41（1）：41-44.

[15] 常偉，宋福強，王占斌，等.引進菌株Bionectria ochroleuca對幾種植物病原真菌的拮抗效應[J].中國農學通報，2014，30（18）：166-170.

[16] 陳石，李春雨，易干軍，等.尖鐮孢菌致病機理研究進展[J].中國農學通報，2011，27（13）：74-78.

[17] 肖敏，曾向萍，嚴婉榮，等.海南豇豆枯萎病病原鑒定及生物學特性初步研究[J].基因組學與應用生物學，2015，34（2）：345-349.

[18] 汪靜，梁宗鎖，康冰，等.文山三七根腐病病原真菌的鑒定與藥劑防治[J].西北林學院學報， 2015，30（1）：158-163.

[19] 馬駿，劉強，榮湘民，等.防治斜紋夜蛾的爪哇擬青霉菌株篩選及培養[J].湖南農業大學學報（自然科學版）， 2007，33（4）：466-470.