石斑魚遺傳多樣性及其系統發育分析

李慶等

摘要石斑魚不僅是重要的海水經濟魚類，而且具有重要的生態地位。但是，石斑魚的分類、物種多樣性、資源保護及其合理開發等需要對石斑魚系統發育的分析與研究。線粒體基因是研究石斑魚系統進化的理想分子標記，因此獲得了青石斑魚E.awoara長度為1 039 bp 的16S rDNA、tRNA-Leu和NA1部分序列，基于其及ND2、cyt b對石斑魚系統發育進行了分析，結果表明石斑魚遺傳多樣性與地域分布關系不大，不同系統樹分析都表明同一石斑魚物種的系統發生關系基本一致，石斑魚種間親緣關系較近。此外，也發現某些異種間親緣關系比同種間親緣關系近的現象。

關鍵詞石斑魚；遺傳多樣性；系統發育

中圖分類號S965.44；Q17文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）29-075-05

石斑魚是石斑魚屬（Epinephelus）魚類的統稱，隸屬鱸形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、石斑魚亞科（Epinephelinae），其種類多，分布廣。我國有石斑魚種類46種，主要分布在南海和東海南部。石斑魚是重要的世界性海洋經濟魚類之一，在海洋生態中占有重要地位，也是重要的海水增養殖對象。但是，海洋環境污染、過度捕撈、養殖群體的近親繁殖等已使魚類資源不斷衰退，部分種類已被列為瀕危物種。在我國科技興海戰略中，石斑魚的合理開發和資源保護已迫在眉睫。

石斑魚為定居性魚類，形態保守，石斑魚的分類多以體形、條紋、體色、斑點、骨骼等性狀為主要依據。但是不同生境、應激狀態及不同發育階段下，很多石斑魚種類的體色和斑紋常會發生明顯變異，石斑魚種類鑒定困難，有時會造成種類鑒定上的失誤，增加了系統發生關系研究的難度。此外，石斑魚中還存在同名異種及同種異名的現象，甚至在生態系統破壞壓力之下，石斑魚親緣關系相近的種類可能也存在雜交現象。因此，這給物種多樣性研究、漁業資料保護和合理利用及石斑魚育種養殖帶來一定的困難，也給養殖生產中親本和魚種的引進和鑒定帶來了一定的困難。然而，隨著分子生物學的發展，分子系統學方法的應用為石斑魚傳統分類提供了重要佐證和補充修正。

動物線粒體DNA具有序列簡單和進化速度快等特點，在魚類分子系統學研究中得到廣泛應用。對石斑魚線粒體DNA的分析表明，線粒體基因，尤其是16S rDNA、cyt b和ND2基因是對石斑魚屬內種間系統進化分析進行評估的理想分子標記[5-7]。筆者獲得了青石斑魚（E.awoara）的16S rDNAtRNALeuDA1序列（16S rDNA、tRNALeu和部分DA1序列），分析石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1的遺傳多樣性，比較青石斑魚（E.awoara）分子系統發育關系與傳統分類的異同，并基于目前GenBank數據庫中已知石斑魚cyt b和ND2基因完整序列分析石斑魚的系統發生關系及空間距離對石斑魚遺傳多樣性的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用石斑魚。青石斑魚（E.awoara）購自湛江某石斑魚養殖場，活體運回實驗室后，取肌肉組織放入-80 ℃超低溫冰箱中備用。試驗所用其他石斑魚相關信息及基因序列來源于GenBank數據庫。

1.1.2菌株與載體。大腸桿菌DH5α菌株由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保存，pMD18T載體pEGFPN3載體購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取。取青石斑魚（E.awoara）肌肉組織約50 mg，采用傳統的酚-氯仿抽提方法進行基因組DNA提取。

1.2.2青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1的克隆。

根據GenBank數據庫上的同源序列設計并擴增青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1基因的引物為16SF （5′GGCTGTGGAGTCAACCAG–3′）和16SR （5′GGCTTHAGRTCTCTGTG3′）。

PCR反應體系（25 μl）為：ddH2O 15.5 μl、DNA（約30 ng）2 μl、引物（10 μmol/L） 1 μl、dNTPs （2.5 mmol/L） 2 μl、10×ExTaq Buffer 2.5 μl、ExTaq酶 （1 U/μl） 0.125 μl。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳產物純化回收后與pMD18T載體連接，轉化至大腸桿菌 DH5α菌株，篩選陽性克隆并送至上海生工生物有限公司測序鑒定。

1.2.3石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2遺傳多樣性及石斑魚系統發育分析。

應用DNAstar軟件（Lasergene）并結合人工調整，對石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2序列分別進行排列；應用MEGA軟件分析變異位點、信息位點和遺傳距離。

應用ModelTest分別模擬石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2進化模式，并將不同的模擬結果作為參考值構建系統樹。基于16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2分別用MEGA軟件構建最大簡約樹（MP）、最大似然樹（ML）、最小進化樹（ME）、非加權組平均樹（UPGMA）和鄰接樹（NJ）。分別用MrBayes軟件進行Bayesian分析，并采用genera1timereversible+gamma+invariants（GTR+G+I）序列進化模型和Markov Chain Monte Carlo（McMc）取樣方式估計系統發生關系。MrBayes分析參數為：nst=6，rates=gamma，進行100 000 次重復檢驗后，獲得系統樹的支系結構和各支的置信度。后驗概率和系統樹枝長計算參數為：bumin=500，contype=allcompat。分別用PAUP軟件進行運算，Heuristic搜索采用二分支方式構建系統樹支系（TBR branch swapping），并加入隨機序列重復抽樣；系統樹各支的置信度，通過Bootstrap[12]重復抽樣1 000次后獲得。同時，基于CYTB和ND2蛋白序列構建系統樹。

2結果與分析

2.1青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1的克隆

從圖1可以看出，經PCR擴增、克隆和測序，獲得青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列，長度為1 039 bp（GenBank編碼：KR703819），經Blast檢索其與青石斑魚E.awoara 相應基因（JX109835）的相似率為97.7%。

2.2石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1遺傳多樣性及基于其石斑魚系統發育分析

分析27尾魚的16S rDNAtRNALeuDA1序列含有308個變異位點和160簡約信息位點。對石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列分析發現，采集于同一地域的分離株16S rDNAtRNALeuDA1的同源率為100%，如采集于我國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377、KJ700440、KM458971和NC011113）、寶石石斑魚E.areolatus（KC466080、KC593374和NC020785）、青石斑魚E.awoare（JX109835和NC018773）、橙點石斑魚E.bleekeri（KF556648和NC022848）、斜帶石斑魚E.coioides（NC011111、EU043376和KM377093）、小紋石斑魚E.epistictus（KC816460和NC021462）、擬青石斑魚E.fasciatomaculosus（KC480085和NC020782）、褐點石斑魚E.fuscoguttatus（JX119192和NC020046）、鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ4723837和NC011715）、寬帶石斑魚E.latifasciatus（KC480177和NC020784）、云紋石斑魚E.moara（JQ518290、KP009977和NC017891）、玳瑁石斑魚E.quoyanus（KC790539和NC021450）、六帶石斑魚E.sexfasciatus（KC959953和NC021765）、南海石斑魚E.stictus（KC527593和NC021133）、三斑石斑魚E.trimaculatus（KC847086和NC021612）與黑斑石斑魚E.tukula（KJ414470和NC024039），采集于韓國的褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和NC013820）與七帶石斑魚E.septemfasciatus（FJ594966和NC013829）以及采集于日本的蜂巢石斑魚E.merra（AP005991和NC022509）。將GenBank數據庫中非相同的石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列進行比對，計算兩兩序列間的相似度和遺傳距離（表1），并構建系統樹（圖2）。

基于石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列所構建系統樹的拓撲結構基本一致，石斑魚分為兩大分支，石斑魚兩兩間的遺傳距離普遍較小；從遺傳距離和系統樹分析來看，該試驗所用石斑魚確定為青石斑魚（E.awoara），與傳統方法分類相一致；采集于不同地域的同一種石斑魚多聚在一起，如采集于中國和韓國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377/China和KJ700439/Korea）以及采集于中國和馬來西亞的鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ472837/China、KM386619/China、KJ451389/ China和HQ660062/Malaysia）；但采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）沒有聚在一起，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）卻與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）聚在一起。采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China間的遺傳距離為0.013，而褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的遺傳距離僅為0.001。呈現出的矛盾是褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的親緣關系比褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）二者間的親緣關系更近，因此將基于石斑魚cyt b和ND2基因序列進一步分析石斑魚間的系統發生關系。

2.3石斑魚ND2基因遺傳多樣性分析及基于ND2基因石斑魚系統發育分析

分析中ND2基因序列含有641個變異位點和413個簡約信息位點。石斑魚ND2基因序列分析結果與16S rDNAtRNALeuDA1分析結果基本一致，采集于同一地域的分離株ND2的同源率多為100%，如采集于中國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377和NC011113）、寶石石斑魚E.areolatus（KC466080和NC020785）、青石斑魚E.awoare（JX109835和NC018773）、布氏石斑魚E.bleekeri（KF556648和NC022848）、斜帶石斑魚E.coioides（NC011111、EU043376和KM377093）、小紋石斑魚E.epistictus（KC816460和NC021462）、擬青石斑魚E.fasciatomaculosus（KC480085和NC020782）、褐點石斑魚E.fuscoguttatus（JX119192和NC020046）、鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ4723837和NC011715）、寬帶石斑魚E.latifasciatus（KC480177和NC020784）、云紋石斑魚E.moara（JQ518290、KP009977和NC017891）、玳瑁石斑魚E.quoyanus（KC790539和NC021450）、六帶石斑魚E.sexfasciatus（KC959953和NC021765）、南海石斑魚E.stictus（KC527593和NC021133）、三斑石斑魚E.trimaculatus（KC847086和NC021612）與藍身大斑石斑魚E.tukula（KJ414470和NC024039），采集于韓國的褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和NC013820）與七帶石斑魚E.septemfasciatus（FJ594966和NC013829）以及采集于日本的蜂巢石斑魚E.merra（AP005991和NC022509）。

基于石斑魚ND2基因序列和ND2蛋白序列構建系統樹的拓撲結構基本一致，石斑魚分為兩大分支，石斑魚兩兩間的遺傳距離普遍較小；同一種石斑魚多聚在一起，與不同地域的關系并不大，如采集于中國和韓國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377/China、KJ700440、KM458971和KJ700439/Korea）及采集于中國和馬來西亞的鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ472837/China、KM386619/China、KJ451389/China和HQ660062/Malaysia）；但是，采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China沒有聚在一起，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）卻與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）聚在一起。采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China二者間的遺傳距離為0.052，而褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的遺傳距離僅為0.001。這再次表現出與基于16S rDNAtRNALeuDA1分析相同的矛盾，即褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的親緣關系比褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）二者間的親緣關系更近（圖3）。

2.4石斑魚cyt b基因的遺傳多樣性分析及基于cyt b基因石斑魚系統發育分析

已知石斑魚cyt b基因序列較多，140尾橫帶石斑魚（E.fasciatus）不同個體cyt b基因序列間相似度為95.4%～99.9%，24尾褐點石斑魚（E.fuscoguttatus）不同個體cyt b基因間的相似度為97.5%～99.9%。

基于石斑魚cyt b基因序列和CYTB蛋白序列構建系統樹的拓撲結構基本一致，石斑魚分為兩大分支，此系統樹覆蓋石斑魚種類較多，系統發育關系比較復雜。

從系統發育樹來看，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）、云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）與布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558）聚為一小分支，而布氏石斑魚E.bleekeri（KF556648）與鮭點石斑魚E.fario（DQ372726和DQ486931）又聚為另一小分支，且此2個小分支相距較遠。從遺傳距離和相似率來看，2尾布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558和KF556648）間的遺傳距離和相似

率分別為0.151和86.1%，而其與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）間的遺傳距離分別和相似率分別為0.001、0.002和95.8%、95.9%或0.160、0.161和85.1%、85.2%，與鮭點石斑魚E.fario（DQ372726和DQ486931）間遺傳距離和相似率分別為0.151、0.153和

85.9%、86.1%和相似率分別或0.007、0.009和99.1%、99.3%。褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）的遺傳距離和相似率分別為0.001、0.002和99.8%、99.9%或 0.043、0.044和95.8%、95.9%），而兩尾褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）間的遺傳距離和相似率分別為 0.043和95.9%，三尾云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）間的遺傳距離和相似率分別為0.002、0.003和99.7%、99.8%。這再次呈現出與上述相似的矛盾，即布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）或布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558）與鮭點石斑魚E.fario（DQ486931）的親緣關系比兩尾布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558和KF556648）的親緣關系還要近；褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427）的親緣關系比兩尾褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）的親緣關系要近，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427）的親緣關系類似于三尾云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）簡的親緣關系（圖4）。

3討論

筆者對石斑魚進行分子系統學研究，為石斑魚傳統分類提供了重要佐證和補充修正，在一定程度上減少物種鑒定的誤差。該研究所用石斑魚為青石斑魚（E.awoara）與傳統分類學鑒定結果相同。此外，該研究基于石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、ND2和cyt b對石斑魚系統發生關系和遺傳距離的分析發現，石斑魚遺傳多樣性與地域分布關系不大。從系統發育樹來看，基于石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、ND2基因構建的系統樹兩大分支物種相同，而基于石斑魚cyt b基因構建的系統樹石斑魚兩大支物種則有所不同，可能與此系統樹所含石斑魚物種比上述系統樹所含石斑魚物種較多有關，但此3個系統樹中相同物種石斑魚系統發生關系基本一致。同時，也再次證實了石斑魚線粒1體16S rDNA、ND2和cyt b基因可用于石斑魚分子系統學研究分析，目前已知石斑魚的cyt b基因最多，相關信息也較多，由此認為cyt b基因是研究石斑魚分子系統學的優先選擇標記。

石斑魚分子系統學分析為相關科研和養殖應用帶來了很大幫助，筆者在該研究中不僅發現石斑魚種間親緣關系非常近，但也發現一些其他問題，如有的褐石斑魚E.bruneus與云紋石斑魚E.moara的親緣關系比褐石斑魚間的親緣關系還近，與云紋石斑魚E.moara間的親緣關系相似；有的布氏石斑魚E.bleekeri與云紋石斑魚E.moara或與鮭點石斑魚E.fario的親緣關系比布氏石斑魚E.bleekeri間的親緣關系還要近。這些問題的解決有待深入研究。同時，這些問題的呈現也說明了在石斑魚物種多樣性、漁業資料保護和合理利用及石斑魚育種養殖等方面的困難和不便，同時也體現了生態系統破壞給石斑魚生存帶來的壓力。研究表明，鹽度對斜帶石斑魚E.coioides生長、生理及抗病能力有顯著影響，鹽度漸變和驟變對褐點石斑魚E.fuscoguttatus存活和攝食也有影響[14]。

為徹底解決目前石斑魚面臨的問題，應保護石斑魚的物種多樣性、保護生態環境，深入研究石斑魚分類學和分子系統學，及時更正、修正已出現的失誤等。石斑魚種質資源問題不容忽視，如斜帶石斑魚E.coioides已被國際自然資源保護聯盟列入近危種[15]。

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