部分景天屬植物DNA條形碼引物的篩選

張洋　郝海葉　那冬晨

摘要[目的] 對(duì)景天屬植物分類所需用的相關(guān)DNA條形碼引物進(jìn)行篩選。 [方法]以景天屬（Sedum）中的佛甲草、八寶景天、華北景天、費(fèi)菜、垂盆草5種植物為研究材料，采用CTAB法分步提取核DNA和葉綠體DNA，PCR擴(kuò)增篩選引物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。[結(jié)果]從psbAtrnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK 6個(gè)候選序列引物中初步篩選出適合景天屬植物DNA條形碼的4對(duì)引物——psbAtrnH、ropB、rpoC1、ITS 2，這4對(duì)引物的擴(kuò)增率均達(dá)到100%。[結(jié)論]為景天屬植物DNA條形碼研究提供相關(guān)依據(jù)。

關(guān)鍵詞景天屬植物；引物篩選；DNA條形碼

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）16-053-02

The Primers Selection of Sedum Plants DNA Barcoding

ZHANG Yang， HAO Haiye， NA Dongchen*

（Life Science College， Shanxi Normal University， Linfen，Shanxi 041004）

Abstract[Objective] The aim was to select relevant DNA barcoding primers that the classification of Sedum plants needed. [Method] Choosing 5 species from Sedum plants as research materials， which was Sedum lineare Thunb，Sedum spectabile Boreau，Sedum tatarinowii Maxim，Sedum aizoon L. and Sedum sarmentosum Bunge. Chloroplasts DNA and nuclear DNA of 5 species from Sedum plants were extracted by CTAB method to stepbystep extracting， primers were selected by PCR， PCR productions were tested by agarose gelelectrophoresis.[Result] Four pairs of primers（psbAtrnH、ropB、rpoC1、ITS 2） had been obtained preliminarily from six pairs candidate primers（psbAtrnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK）. The amplification rate of four pairs primers reached 100%. [Conclusion] The study provided related basis for studying DNA barcoding of Sedum plants.

Key wordsSedum plants； Primers selection； DNA barcoding

景天屬（Sedum）植物多為一年生或多年生草本，大多為肉質(zhì)植物，莖葉多汁液，耐旱性極強(qiáng)，花朵美麗，花色豐富。植株矮小，株高20～50 cm。景天屬在我國(guó)共有124種，1亞種，14變種以及1變型，大多數(shù)產(chǎn)于熱帶干旱地區(qū)，主要野生于巖石地帶、山坡石縫、林下石質(zhì)坡地、山谷石崖等處。喜光照，適生溫度為15～18 ℃，部分種耐陰，對(duì)土質(zhì)要求不嚴(yán)[1]。喜濕潤(rùn)，但忌澇[2]，性耐寒，宜于砂壤土生長(zhǎng)。

DNA條形碼（DNAbarcoding）是利用DNA片段快速鑒別物種的基因工具，可通過(guò)比對(duì)一段較短的DNA序列進(jìn)行物種鑒定。在理論上，這段短序列可以區(qū)分并鑒定地球上所有物種。構(gòu)建DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用該項(xiàng)技術(shù)鑒別己知物種和發(fā)現(xiàn)新物種，是目前分子生物學(xué)和分類學(xué)發(fā)展的最

新方向[3]。筆者以部分景天屬植物為材料，尋找該屬植物

DNA條形碼的適宜引物，為確定該屬植物的DNA條形碼序列、快捷有效地鑒別該屬植物奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可促進(jìn)該屬植物親緣學(xué)和化學(xué)分類學(xué)等的研究。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

佛甲草、八寶景天、華北景天、費(fèi)菜、垂盆草。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取。

分別采摘上述5種植物生長(zhǎng)良好的嫩葉，進(jìn)行葉綠體DNA和核DNA的分步提取[4-6]。所得DNA于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2引物篩選。

參考相關(guān)的DNA條形碼通用序列研究資料，結(jié)合景天屬植物的形態(tài)特征和生理特征，初步選取psbAtrnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK作為候選序列（表1）。

表1候選引物序列

序列名稱引物名稱堿基序列（5′-3′）濃度∥μmol/L基因組序列大小∥bp

psbAtrnHPAGTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C10葉綠體400～700

THCGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC10

ropBrB1fAAG TGC ATT GTT GGA ACT GG10葉綠體400～500

rB4rGAT CCC AGC ATC ACA ATT CC10

rbcLrl1ATG TCA CCA CAA ACA GAA AC10葉綠體500～700

rl2TCG CAT GTA CCT GCA GTA GC10

rpoC1rpoC12fGGC AAA GAG GGA AGA TTT CG10葉綠體500～600

rpoC14rCCA TAA GCA TAT CTT GAG TTG G10

matK390fCGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C10葉綠體900～1 000

1326rTCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T10

ITS 2IT5afCCT TAT CAT TTA GAG GAA GGA G10核400～500

IT4rTCC TCC GCT TAT TGA TAT GC10

對(duì)上述6對(duì)候選序列引物進(jìn)行篩選，并進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化。各對(duì)引物相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件見表3。其中matK序列需要進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，第2次擴(kuò)增以第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用同樣的反應(yīng)條件進(jìn)行第2次擴(kuò)增。

表2PCR反應(yīng)體系

μl

反應(yīng)體系各組分葉綠體DNA引物總DNA引物

Buffer（10×）2.5 4.0

dNTP（10 mmol/L）0.5 0.5

ddH2O18.5 16.8

5′引物0.5 0.5

3′引物0.5 0.5

Taq酶（2 U/μl）0.5 0.7

DNA模板2.0 2.0

總體積25.0 25.0

表3PCR反應(yīng)條件

序號(hào)程序

psbAtrnH、rbcL溫度∥℃時(shí)間

ropB、rbcL、matK溫度∥℃時(shí)間

ITS 2溫度∥℃時(shí)間∥min

1預(yù)變性94.05 min94.04 min94.05

2變性94.01 min94.030 s94.01

3退火55.050 s53.040 s55.01

4延伸72.01 min72.040 sc72.01.5

5go to 235循環(huán)go to 235循環(huán)go to 235循環(huán)

6延伸72.07 min72.0772.07

1.2.3電泳檢測(cè)。

提取的核DNA和葉綠體DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1葉綠體DNA序列引物的篩選

2.1.1psbAtrnH、ropB、rpoC1。

研究表明，psbAtrnH、ropB、rpoC1 3對(duì)引物均可作為景天屬植物的DNA條形碼引物。3對(duì)引物的擴(kuò)增率都達(dá)到100%，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為250～450 bp、500 bp左右、500～650 bp，且種間差異明顯，種內(nèi)差異較小（圖1～3）。

注：1.佛甲草；2.八寶景天；3.華北景天；4.費(fèi)菜；5.垂盆草。

圖1psbA-trnH序列擴(kuò)增結(jié)果

注：1.佛甲草；2.八寶景天；3.華北景天；4.費(fèi)菜；5.垂盆草。

圖2ropB序列擴(kuò)增結(jié)果

注：1.佛甲草；2.八寶景天；3.華北景天；4.費(fèi)菜；5.垂盆草。

圖3rpoC1序列擴(kuò)增結(jié)果

2.1.2rbcL、matK。

研究表明，rbcL、matK 2對(duì)引物不適合作為景天屬植物DNA條形碼的引物。其中rbcL序列的擴(kuò)增率僅為40%，擴(kuò)增出來(lái)的片段大小在750 bp左右。matK序列經(jīng)過(guò)2次擴(kuò)增未能檢測(cè)到相關(guān)產(chǎn)物。

2.2核DNA序列引物的篩選

ITS 2序列PCR擴(kuò)增率也達(dá)到100%，擴(kuò)增片段大小為700～750 bp（圖4）。

注：1.佛甲草；2.八寶景天；3.華北景天；4.費(fèi)菜；5.垂盆草。

圖4ITS 2序列擴(kuò)增結(jié)果

3結(jié)論與討論

（1）該試驗(yàn)最終在psbAtrnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK 6對(duì)引物中成功篩選出3對(duì)葉綠體DNA引物對(duì)（psbA-trnH、ropB、rpoC1）和1對(duì)總DNA引物對(duì)（ITS 2）。這4對(duì)引物可以進(jìn)行相互組合，從而能更好地對(duì)景天屬植物進(jìn)行分類。

（2）據(jù)文獻(xiàn)記載，ITS 2序列大小一般在400～500 bp，而該試驗(yàn)經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，結(jié)果顯示ITS 2序列大小為700～750 bp；另有文獻(xiàn)顯示一些景天科植物中rbcL的擴(kuò)增率達(dá)100%，該試驗(yàn)進(jìn)行多次重復(fù)，擴(kuò)增率均不超過(guò)40%。以上差異之處還有待于進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

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