黑龍江省不同緯度耕作土壤中可培養細菌群落結構解析

王 淼，王繼華，張雪萍，周小倩 (哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，黑龍江哈爾濱 150025)

土壤是微生物的大本營，是其生長繁殖的天然培養基。土壤中存活著種類極其豐富的微生物類群，主要分為土壤細菌、土壤放線菌和土壤真菌。土壤中以群落形式存在的微生物不僅是土壤養分、有機質循環和轉化的動力，而且影響著土壤的結構、肥力以及地上植物的健康［1］等。土壤微生物群落結構組成及活性變化是衡量土壤質量、維持土壤肥力和作物生產力的重要指標之一。它是土壤生物區系中最重要的功能組分。土壤微生物對環境變化的敏感性也決定它可能首先受到環境變化影響的群體，使其與土壤微生物相關的一系列過程受到影響［2－4］。

黑龍江省作為全國糧食生產大省，農業生產具有舉足輕重的地位。對于耕作土壤的研究更為有意義。該研究樣地土壤類型均為暗棕壤。暗棕壤作為東北地區主要土壤類型之一，其生物活性指標、肥力指標等變化對于指導耕作及提高耕作土壤肥力具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 研究區域與樣地概況 黑龍江省位于我國最北部，屬溫帶、寒溫帶大陸性季風氣候，南北縱跨中溫帶與寒溫帶兩個溫度帶。塔河位于黑龍江省北部(123°19～125°48'E，52°9'～53°23'N)，屬寒溫帶大陸性氣候，年平均氣溫 －5℃，年均降雨量428 mm。帶嶺地處黑龍江省伊春市(128°48'～128°55'E，47°57'～47°14'N)，處于歐亞大陸東緣，深受海洋氣候的影響，具有明顯的溫帶大陸性季風氣候特征，年平均氣溫－0．3℃，年均降雨量676 mm。帽兒山位于黑龍江省尚志市境內(127°30'～127°34'E，45°20'～45°25'N)，氣候屬于大陸性季風氣候，年平均氣溫2．7℃。供試耕作土壤類型均屬暗棕壤(圖1)。

1．2 樣品的采集與處理 2012年9月，在上述3個地區的耕地土壤中設置4個樣方(10 m×10 m)。在每個樣方內隨機設6個采樣點，采集0～15 cm土壤，混合，去除植物殘體和石子，過2 mm篩，均勻分成3份:一份置于4℃冰箱冷藏保存，并盡快進行微生物群落特征分析;一份置于－20℃冰箱，冷凍(備用);第3份置于室內自然條件風干，磨碎，過100目孔徑篩，用于土壤理化性質的測定。黑龍江省3個地區耕地土壤的基本性質見表1。

1．3 測定方法

1．3．1 土壤理化性質的測定。對各采樣點土樣，采用常規土壤理化性質分析法［5－6］測定土壤有機質、全氮、全磷、速效鉀、速效磷含量和pH。

1．3．2 土壤微生物的分離、純化與鑒定。采用傳統稀釋涂平板法對12個土樣中細菌進行分離，并對其數量進行測定。分離培養基為LB培養基［7］。對所得細菌進行個體形態觀察及生理生化試驗，依據經典微生物學分類方法，結合細菌的形態學、生理學及生態學特征，并且參照《伯杰細菌手冊》(第八版)［8］進行鑒定。

1．3．3 數據處理。通過Shannon多樣性指數(H')、Pielou均勻度指數(J)、Margalef豐富度指數(R)和Simpson優勢度指數(C)［9］，對細菌種群多樣性水平進行分析。

式中，Pi為第i種的個體數占總個體數的比例，可以用Pi=Ni/N求出;Ni為第i種物種個體數;N為總個體數;S為每個樣品中的物種總數。

1．3．4 統計分析。數據的方差、標準誤差和相關性分析均采用SPSS 17．0軟件進行，顯著性水平設置為P＜0．05。聚類分析樹形圖應用PRIMER 5軟件進行分析繪制。

典型對應分析主要按照以下步驟進行:①由除趨勢對應分析(Detrended correspondence analysis，DCA)得出種屬的單峰響應值(梯度長度SD)，當SD的數值大于2時即可進行CCA分析;②測試各環境變量的邊界效應，每次只包含一個環境變量的CCA分析，研究單個環境變量對可培養細菌種類的影響，即所謂的邊界效應;③環境變量的重要性按照其單獨解釋屬種數據的方差值大小排序，解釋的顯著性由Monte Carlo 測試來檢驗［10－12］。

表1 黑龍江省3個地區耕地土壤的基本理化性質

2 結果與分析

2．1 黑龍江省耕作土壤中可培養細菌的種類與數量組成特點 由圖2可知，隨緯度的降低，塔河、帶嶺、帽兒山3個樣地耕地土壤中可培養細菌數量降低，塔河耕地土壤中可培養細菌顯著高于帶嶺與帽兒山樣地(P＜0．05)，分別比帶嶺和帽兒山高30．53%和52．67%。

通過對黑龍江省3個地區的12個樣地土壤細菌的分離、純化，并經生理生化試驗鑒定，發現所得細菌分屬于29個種屬(圖3)。不同地區耕作土壤可培養細菌的種群組成和結構存在一定的差異。各可培養細菌屬種在不同地區耕作土壤中的優勢度也有所不同。

塔河樣地耕地土壤中可培養細菌分屬15個種屬。固氮菌屬(Azotobacte)、芽孢桿菌屬(Bacillus)與芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)是塔河供試土壤類群中數量最多的類群，分別占可培養細菌總數的28．97%、16．27%和11．90%，是該土壤中的優勢種群;而微球菌屬(Micrococcus)、假單胞菌屬(Pseudomomas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、動性球菌屬(Planococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)分別占供試土壤可培養細菌總數的9．13%、8．33%、7．54%、5．75%、4．76%、1．59%、1．59%和 1．59%，是該土壤中的亞優勢種群;其他菌屬(副球菌屬(Paracoccus)、氮單胞菌屬(Azomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)及利斯特氏菌屬(Liste-ria))是塔河供試土壤中的稀有種群。

帶嶺耕地土壤中可培養細菌分屬于20個種屬。芽孢桿菌屬、固氮菌屬、不動桿菌屬、副球菌屬是帶嶺供試土壤類群中數量最多的類群，分別占可培養細菌總數的30．97%、16．54%、11．93%和 10．22%，是該土壤中的優勢種群;而芽孢八疊球菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、土壤桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬(Flavobacterium)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)和氣微菌屬(Aeromicrobium)分別占供試土壤可培養細菌總數的 7．54%、4．14%、3．16%、3．16%、2．92%、2．19%、1．95% 和1．22%，是該供試土壤中的亞優勢種群;其他菌屬(變形菌屬(Proteus)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、發光桿菌屬(Photobacterium)、利斯特氏菌屬、黃單胞菌屬(Xanthomonas)和檸檬酸細菌屬(Citrobacter))是帶嶺供試土壤中的稀有種群。

帽兒山耕地土壤中可培養細菌分屬于18個種屬。芽孢桿菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬、固氮菌屬是帽兒山供試土壤類群中數量最多的類群，分別占可培養細菌總數的34．45%、13．01% 、12．48% 和 11．60%，是該供試土壤中的優勢種群;而芽孢八疊球菌屬、黃單胞菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬、利斯特氏菌屬、動性球菌屬、動膠菌屬(Zoogioea)和微桿菌屬(Microbacterium)分別占供試土壤可培養細菌總數的 6．85%、5．80%、3．51%、2．28%、2．11%、2．11%、1．05%和1．05%，是該供試土壤中的亞優勢種群;其他菌屬(副球菌屬、變形菌屬、片球菌屬、土壤桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)和短小桿菌屬(Curtobacterium))是帽兒山供試土壤中的稀有種群。

2．2 黑龍江省不同地區耕作土壤中可培養細菌組成的相似性 由圖4可知，3個樣地土壤樣品可培養細菌種群的相似性系數為61．11% ～70．59%，表明土壤樣品之間存在差異性。當相似性系數為61．11%時，供試的3個樣地土壤可明顯分為2組。其中，組1包括帽兒山和塔河土樣，組2為帶嶺土樣。這說明帽兒山耕作土壤可培養細菌與塔河土樣之間的親緣關系最近，而與帶嶺耕作土壤中可培養細菌種群差異較大，同源性較低。帽兒山樣地與塔河樣地土壤中可培養細菌組成的相似性較高，相似系數為70．59%，而帶嶺樣地土壤中可培養細菌組成與之相似性則較低，與帽兒山和塔河樣地的相似性分別為63．16%和61．11%。

2．3 不同地區耕作土壤可培養細菌多樣性特點 不同的多樣性指數可反映土壤微生物群落多樣性的不同方面。Shannon多樣性指數是反映群落物種及其個體數與分布均勻度的指標;均勻度指數是群落物種均一性的指標［13－15］。由表2可知，不同地區耕作土壤可培養細菌的多樣性水平存在差異。帽兒山樣地土壤可培養細菌的多樣性與豐富度指數均最高，分別為1．84和1．86，在0．05水平顯著高于塔河樣地與帶嶺樣地。3個樣地土壤可培養細菌的均勻度指數和優勢度指數均無顯著性差異。均勻度指數趨勢為塔河＞帶嶺=帽兒山，優勢度指數趨勢為帶嶺＞塔河＞帽兒山。

表2 黑龍江省不同地區耕作土壤可培養細菌種群的多樣性指數

2．4 土壤可培養細菌種類與環境因子對應關系的CCA分析 DCA分析顯示，塔河、帶嶺和帽兒山土壤可培養細菌群落梯度長度分別為2．332、3．998和2．862，表明黑龍江省這3個地區耕地土壤可培養細菌群落對生態梯度的響應是非線性的，因此利用非線性響應模型(CCA)來分析環境因子對土壤可培養細菌群落的影響是比較適宜的。

塔河樣地CCA分析的前兩軸特征值分別為0．46和0．38，種類與環境因子排序軸的相關系數均達到1．00，說明排序圖很好地反映土壤可培養細菌與環境因子之間的關系。該排序圖的前兩軸解釋了塔河耕作土壤可培養細菌群落變異程度的76．3%。由此可知，排序軸的前兩軸能夠真實地反映環境因子對細菌種屬分布的影響程度，且與環境因子的相關性軸1 大于軸2。軸1 與 AK、TP、AP、TN、OM 呈0．05 水平顯著負相關，而軸2只與OM呈0．05水平顯著負相關，與pH呈現0．05水平顯著正相關。從箭頭的長度可以看出，環境因子對可培養細菌分布的相關性大小為AP＞OM＞TN＞TP＞AK＞pH。從箭頭與軸1的夾角可以看出，環境因子與可培養細菌種屬相關性的大小為OM＞TN＞TP＞AP＞AK＞pH。物種之間的線段距離長短代表了物種之間的親緣關系。由圖5可知，固氮菌屬和鏈球菌屬，葡萄球菌屬和不動桿菌屬，固氮菌屬和芽孢桿菌屬，利斯特氏菌屬和土壤桿菌屬，鏈球菌屬、動性球菌屬和氣球菌屬分布差異較小。

帶嶺樣地CCA分析的前兩軸特征值分別為0．69和0．58，種類與環境因子排序軸的相關系數均達到1．00。該排序圖的前兩軸解釋了帶嶺耕作土壤可培養細菌群落變異程度的71．8%，能夠真實地反映環境因子對細菌種屬分布的影響程度，與環境因子的相關性軸1大于軸2。軸1與AK、TP、AP、TN呈0．05水平顯著正相關，而軸2與AK、AP呈0．05水平顯著負相關，與TN呈0．05水平顯著正相關。環境因子對可培養細菌分布的相關性大小為TN＞AK＞TP＞AP＞pH＞OM，環境因子與可培養細菌種屬相關性的大小為AP＞AK＞OM＞pH＞TP＞TN。由圖6可知，葡糖桿菌屬、黃桿菌屬和氣微菌屬、固氮菌屬和不動桿菌屬，短狀桿菌屬、葡萄球菌屬、黃單胞菌屬和利斯特氏菌屬，副球菌屬和土壤桿菌屬，以及芽孢八疊球菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬、發光桿菌屬、放線桿菌屬、變形菌屬、檸檬酸細菌屬、氣微菌屬之間的親緣關系較遠。

帽兒山樣地CCA分析的前兩軸特征值分別為0．43和0．17，種類與環境因子排序軸的相關系數均達到1．00。該排序圖的前兩軸解釋了帶嶺耕作土壤可培養細菌群落變異程度的89．9%，細菌種屬分布與環境因子的相關性軸1大于軸2。軸1與AK呈0．05水平顯著負相關，而與TN呈0．05水平顯著正相關，而軸2與AK、AP、OM、pH值呈0．05水平顯著負相關。環境因子對可培養細菌分布的相關性大小為TN＞AK＞OM＞pH＞AP＞TP，環境因子與可培養細菌種屬相關性的大小為TN＞AK＞OM＞pH＞AP＞TP。由圖7可知，芽孢桿菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬和黃單胞菌屬，固氮菌屬和利斯特氏菌屬，以及變形菌屬、片球菌屬、短小桿菌屬、短桿菌屬、土壤桿菌屬和微桿菌屬之間的親緣關系較遠。

3 結論與討論

3．1 耕作土壤可培養細菌群落組成特征 通過對塔河、帶嶺和帽兒山3個地區耕作土壤可培養細菌的分離，發現固氮菌屬和芽孢桿菌屬是3個樣地耕作土壤中可培養細菌的共同優勢類群，表現出對環境普適性。不同地區耕作土壤中的可培養細菌種類組成、數量和分布具有較大的差異，氣球菌屬、氮單胞菌屬和鏈球菌屬是從塔河樣地耕作土壤中分離得到的特有的可培養細菌種屬，黃桿菌屬、短狀桿菌屬、氣微菌屬、葡糖桿菌屬、放線桿菌屬、發光桿菌屬、檸檬酸細菌屬是帶嶺樣地所分離得到的特有細菌種屬，帽兒山樣地所特有的可培養細菌為短小桿菌屬、短桿菌屬、微桿菌屬與動膠菌屬。特有類群對環境因子的耐受性較小。由于環境的異質性使其分布于不同的地區，因此3個不同地區耕作土壤中均有各自特有的可培養細菌類群。這與慕樂艷等［9］對黑龍江省藥用植物根際土壤真菌的種群結構各區系分布特點研究結果基本一致。特有類群生態適應性弱，只有在一定環境條件下才能生存，因此能夠反映環境的差異，對環境的變化具有一定的指示作用。由此可見，對于不同地區耕地土壤可培養細菌的研究，應著重分析特有類群，進行土壤特有種群與環境關系的研究，從而更好地對耕作土壤肥力變化趨勢進行評價。

雖然塔河、帶嶺與帽兒山緯度相差較大，但三者耕作土壤可培養細菌組成的相似性較高，分別為70．59%、63．16%和61．11%。這可能是由于3個樣地土壤類型均為暗棕壤，而土壤類型是決定土壤微生物群落結構的主要因素，相同土壤類型的土壤微生物群落結構也相似［16－19］。

3．2 耕作土壤可培養細菌多樣性特點 多樣性指數是土壤微生物群落多樣性的重要指標，由物種的豐富度和物種的均勻度兩個部分組成［20］。Shannon多樣性指數、Evenness均勻度指數、Margalef豐富度指數和Simpson優勢度指數是研究生物多樣性的重要指標。它們與土壤環境影響密切相關。該研究對4項多樣性指數進行分析，發現不同理化性質的耕作土壤可培養細菌的多樣性存在差異。通過相關性分析，發現多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數有著密切的關系，對物種群落特征具有一致性的反映。塔河樣地耕作土壤有機質含量最高，可培養細菌數量也最高。這與胡亞林等［21］研究結果一致。塔河樣地土壤可培養細菌的豐富度指數為0．81，高于帶嶺、帽兒山樣地。這也是由于塔河樣地耕作土壤有機質含量較高，而土壤對微生物的緩沖能力較強，均勻度指數隨土壤有機質含量的增加而增加［22］。土壤中微生物群落越復雜、越豐富，則土壤生態系統越穩定，系統的生態功能越高，對外界環境變化的緩沖能力效應越強。研究中，帽兒山樣地耕作土壤可培養細菌的多樣性指數與豐富度指數均最高，分別為1．84與1．86，表明帽兒山樣地耕作土壤生態系統穩定且有利于農業的可持續發展。

3．3 土壤可培養細菌群落與環境因子的相關性 土壤微生物是土壤有機體與無機體相互轉化的作用者、土壤營養物質循環的參與者以及構成土壤肥力的重要因素。土壤微生物本身也是活性的營養庫。它可分解有機物質形成腐殖質，并且釋放養分，參與土壤C、N、P和S等元素的循環過程及土壤礦物的礦化過程［23］。土壤 pH、鹽分、總氮［24－27］、有機質含量［28］等均對土壤微生物群落結構具有十分重要的影響。CCA結果顯示，土壤中微生物群落是由各土壤理化性質共同作用的結果，塔河、帶嶺和帽兒山樣地CCA排序軸1均與總氮顯著相關(相關系數分別達 －0．89、0．74 和0．99)。這可能與土壤中參與氮轉化的微生物功能群有關。生物限制因子——氮元素在土壤中的含量變化會引起土壤微生物生物量、活性和群落組成的變化［29－31］。

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