口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白VP1H2d限制性CTL表位預測

尚延麗　馮霞　靳野等

摘要[目的] 預測A型口蹄疫病毒結構蛋白VP1的H2d限制性T細胞表位。[方法] 使用多種在線表位預測軟件，包括Syfpeithi 、IEDB、NetMHC3.2、IMTECH和BIMAS預測A型口蹄疫病毒VP1上可能有的H2d限制性T細胞表位，然后用ProtParam軟件分析預測出的候選表位。[結果] 綜合比較5個表位預測軟件的預測結果，遴選出10個候選表位；再結合ProtParam軟件分析結果，最后共預測出5個表位：其中H2Kd限制性表位有第27～35、118～126位，H2Ld 限制性表位有第43～51位，H2Dd 限制性表位有第45～53、146～154位。[結論] 預測出5條口蹄疫病毒結構蛋白VP1 H2d限制性CTL表位，為進一步鑒定口蹄疫病毒CTL表位提供數據和基礎。

關鍵詞口蹄疫病毒；結構蛋白VP1；H2d限制性T細胞表位；生物信息學

中圖分類號S855.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）16-146-04

Prediction of H2d Restricted CTL Epitope of Structural Protein VP1 of FMDV A/GDMM/CHA/2013 Strains

SHANG Yanli， FENG Xia， JIN Ye， MA Junwu* et al （State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology， National Foodandmouth Disease Reference Laboratory， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou， Gansu 730046）

Abstract [Objective] To predict the H2d restricted T cell epitopes of structural protein VP1 in FMDV. [Method] H2d restricted T cell epitopes of structural protein VP1 in FMDV were predicted by use of five Internet website Syfpeithi， IEDB， NetMHC3.2， IMTECH and BIMAS and analyzed by ProtParam. [Result] The result showed that there are 10 candicate epitopes on the basis of the result of the five website Syfpeithi， IEDB， NetMHC3.2， IMTECH and BIMAS. Then， taking the result of ProtParam into consideration， there are 5 candicate epitopes. The H2Kd restricted T cell epitopes are in the regions of 27-35 and 118-126； the H2Ld restricted T cell epitopes is in the regions of 43-51； the H2Dd restricted T cell epitopes are in the regions of 45-53 and 146-154. [Conclusion] Five H2d restricted epitopes of structural protein VP1 in FMDV were predicted， which will be helpful for identification of CTL epitopes.

Key words FMDV； Structural protein VP1； H2d restricted T cell epitopes； Bioinformatics

口蹄疫（Footandmouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒引發的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，其嚴重危害畜牧業的發展和國家的經濟貿易。在我國，口蹄疫的防制主要依賴于以強制免疫為主的綜合免疫措施，但目前使用的滅活疫苗[1]存在著許多缺點，研究、開發安全、高效的新型疫苗[2-3]是大勢所趨，而表位肽疫苗正是其研究熱點之一。表位肽疫苗是指同時含有多個目標抗原表位和相應的輔助性表位的一種新型疫苗。抗原表位是指抗原分子表面上有特殊結構與免疫活性的化學基團，它代表抗原分子的一個免疫活性區，是能夠刺激機體產生抗體或致敏淋巴細胞并且能夠被其識別的部位。免疫細胞不是對完整的抗原分子進行識別，而是僅識別抗原肽上的表位。抗原表位按照與不同的抗原受體細胞結合，可分為 B細胞抗原表位與 T細胞抗原表位，而 T細胞表位可分為CTL表位和輔助性 Th 表位。

傳統的表位篩選方法（如合成肽庫法、步移重疊多肽法、酸洗脫法等）工作量大、試驗成本高、試驗周期長，也可能遺漏一些細胞表位。目前，細胞表位篩選方法主要是采用計算機預測軟件預測與實驗法鑒定相結合來篩選細胞表位。計算機表位預測是在已知抗原蛋白結構的基礎上或者已知氨基酸序列的基礎上根據氨基酸的理化數據特質或者肽片段與MHC 分子結合、TAP 轉運過程、蛋白酶體裂解等抗原遞呈過程的規律，將它們編入計算機的算法中，然后用計算機軟件來預測可能含有表位的區域。筆者通過多種計算機表位預測軟件預測口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白VP1上可能的CTL T細胞表位，綜合分析各軟件的預測結果，篩選出最有可能T細胞表位的候選表位，旨在為鑒定口蹄疫病毒CTL細胞表位、研發表位肽疫苗提供數據和基礎。

1材料與方法

1.1FMDV A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白 VP1 的核苷酸和氨基酸序列從GenBank中查詢到FMDV A/GDMM/2013株結構蛋白 VP1 的序列，并與國內外口蹄疫參考毒株進行比較分析。

1.2CTL T細胞表位預測

應用Syfpeithi 、IEDB、NetMHC3.2、IMTECH和BIMAS等多種生物信息學軟件預測FMDV A/GDMM/2013株結構蛋白 VP1上的T細胞表位（表1）。將FMDV A/GDMM/2013 VP1的氨基酸序列輸入各個網站，分別預測了其H2Dd、H2Kd、H2Ld限制性T細胞表位。候選表位氨基酸長度參數為9 mer。選取在各預測軟件上分值在前10位，并且在其他軟件前10位重復率高的肽段做為候選表位。

表1試驗所用的CTL表位預測軟件

預測軟件網址

IMTECHhttp：//www.imtech.res.in/raghava/propred1/

BIMAS http：//wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/

Syfpeithi http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm

IEDBhttp：//tools.iedb.org/mhcii/

NetMHC3.2http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC3.2/

1.3候選表位穩定性預測使用在線分析軟件ProtParam，分析候選表位的理化性質及其穩定性。

2結果與分析

2.1VP1基因序列分析

FMDV A/GDMM/2013株結構蛋白 VP1 基因（KF450794.1）全長 636個核苷酸，編碼 212個氨基酸（圖1～2）。通過GenBank 同源性比對發現，FMDV A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白 VP1 基因與A/HuBWH/CHA/2009 VP1 protein （VP1） gene（JF792355.1） 同源性為91%，與 A/VIT/11/2004 VP1 （1D） gene（HQ116363.1）、A/TAI/7/2003 VP1 （1D） gene（HQ116312.1）、/MAY/3/2003 VP1 （1D） gene（HQ116297.1）同源性為94%。

圖1FMDV A/GDMM/CHA/2013 結構蛋白VP1核苷酸

圖2FMDV A/GDMM/CHA/2013結構蛋白VP1的氨基酸序列

2.2VP1蛋白CTL細胞表位預測

將FMDV A/GDMM/ /CHA/2013結構蛋白VP1蛋白序列輸入到預測軟件，選好MHC的類型及候選表位的長度。每個軟件均選取排名的前10位，然后在每個軟件、每種MHC類型的前10中交叉比較選擇排名靠前且重復率高的10個肽段為候選CTL表位（表2～3）。

表2預測軟件預測的 VP1 蛋白的 CTL表位氨基酸序列

MHC類型編號子序列位置

H2Kd pK1TYYFSDLEI 70～78

H2Kd pK2 RYHTDVGFL 27～35

H2Kd pK3 PYTAPHRVL 118～126

H2Kd pK4 KIIAPAKQL 203～211

H2Ld pL1 KPVGPTHVI 43～51

H2Dd pD1 VGPTHVIDL 45～53

H2Dd pD2 FGAIRATEI 163～171

H2Dd pD3 SGPLAARLA 146～154

H2Dd pD4 KAPFTRLAL 109～117

H2Dd pD5 YCPRPLLAV 184～192

表3篩選出的候選表位在各個軟件中的排名

侯選表位SyfpeithiIEDBNetMHC3.2IMTECHBIMAS

pK111222

pK226112

pK352955

pK498*87

pL127666

pD1 #1211

pD2#2311

pD3#3433

pD4#5555

pD5#9677

注：*表示pK4不在NetMHC3.2預測結果的前10位；#表示Syfpeithi MHC類型沒有H2Dd。

2.3候選表位穩定性預測

采用在線分析軟件ProtParam，分析篩選出的10條候選表位。由表4可知，pK1、pK4、pD2、pD4 和pD5的不穩定指數分別為44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。這5個表位不穩定指數較高，穩定性差，可能不是CTL表位。

表4ProtParam分析結果

候選表位半衰期∥h不穩定指數脂溶指數疏水性平均值

pK17.244.0086.670

pK21.0-3.5975.56-0.311

pK3>20.020.8686.67-0.344

pK41.368.57152.220.389

pL11.312.48107.780.167

pD1 100.0-0.54151.110.811

pD21.142.26108.890.700

pD31.98.89120.000.633

pD41.351.69108.890.367

pD52.843.31130.000.789

3討論與結論

CTL 細胞表面的TCR能夠識別細胞表面展示出的MHC I抗原肽（CTL細胞表位）復合物，并與之結合，然后殺傷靶細胞。CTL在抗腫瘤和抗病毒感染的免疫反應中發揮著重要的作用。當內源性抗原通過MHCⅠ類分子展示于細胞表面后，被CD8T細胞受體識別，在共刺激因子作用下CD8T被活化、增殖產生細胞毒T細胞（CTL）。CTL具有強大的殺傷靶細胞的能力。CTL通過殺傷介質（Perforin、Granayme、Fasl、TRAIL、TNF、IFNγ等）來殺傷靶細胞。CTL在發揮效應時（識別靶細胞和攻擊靶細胞）受MHCⅠ類分子的限制，即CTL只殺傷自身MHC遞呈抗原的靶細胞。由于抗體只能直接結合體液中的抗原，不能通過細胞膜進入細胞內殺傷病原，因此細胞免疫對清除病毒和胞內寄生菌十分重要，CTL通過殺傷靶細胞破壞胞內病原賴以生存的環境，在抗體和吞噬細胞的配合下將病原徹底清除。MHCⅠ類分子僅識別和結合內源性抗原表位，而CTL發揮效應時受MHCⅠ的限制，因此僅由MHCⅠ類分子轉運的抗原表位才能夠誘發CTL效應，這類抗原表位就是CTL表位。

研究表明，自然宿主抗口蹄疫病毒感染的能力與高水平的中和抗體水平有重要相關性。此外，中和抗體的產生離不開Th細胞的輔助作用，因此以前對口蹄疫病毒抗原表位的研究主要是針對B細胞表位和Th細胞表位。但是，有研究表明細胞免疫在FMDV免疫應答中也扮演著非常重要的角色[47]。因此，研究口蹄疫病毒的CTL表位具有重要意義，進一步充實了口蹄疫病毒表位數據庫資料，也為深入了解細胞介導的抗口蹄疫病毒免疫鋪墊了基礎。

該研究的口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株是2013年從我國廣東省茂名市分離的豬源毒，由國家參考實驗室保存。該毒株屬于A型ASIA拓撲性（東南亞）97毒株，其基因與A/HuBWH/CHA/2009（JF792355）同源性小于91.5%，其基因與我國歷史毒株AF/72的同源性小于81.6%，而其基因與2004年越南毒株A/VIT/11/2004大于93.7%。這表明它同我國歷史毒株AF/72無直接遺傳衍化關系，考慮到時間因素，其與2009年流行毒株A/HuB/WH/09應該也無直接遺傳衍化關系，很可能是由境外傳入。初步推測，我國現有疫苗可能對該毒株保護力有限。因此，研究該毒株的細胞表位、發展相應疫苗具有重要意義。

該研究采用多種在線表位預測軟件來預測CTL表位。其中，BIMAS[8]和SYFPEITHI正是采用矩陣方法開發的。IEDB中，MHC I類結合預測工具則是綜合了ANNS（人工神經網絡）[9-12]、SMM（穩定矩陣法）[13]、AMMPMBEC（肽段MHC結合能力與穩定矩陣法）[14]、CombLib（組合庫矩陣法）[15]、Consensus（共識表位預測方法）[16]、NeMHCpan[17-18]、PickPocket（結合槽選擇法）[19]、NetMHCcons（肽段MHC結合預測綜合算法）[20]等多種肽段結合預測方法，而NetMHC3.2則是結合了人工神經網絡和權重矩陣2種方法。計算機表位預測在CTL抗原表位預測方面取得了很多成果。Gao 等使用SYFPEITHI 和 GENETXY 軟件預測O型FMDV結構蛋白VP1上表位，然后將預測的候選表位同重組、表達SLA2（G4S）3β2m蛋白復合體結合，分析候選表位同SLA2（G4S）3β2m蛋白復合體的結合能力，結果表明表位26–34（RRQHTDVSF）和157-165 （RTLPTSFNY）為FMDV CTL表位[21]。Barfoed 等用SYFPEITHI和BIMAS軟件預測候選表位，然后構建了可表達2C蛋白和預測出的候選表位的質粒的DNA疫苗來免疫小鼠，通過胞內細胞因子染色法來檢測免疫后小鼠CD8+細胞IFNγ的合成，結果表明FMDV CS8c1株 2C蛋白上的第63～71 位（KYKDAKEWL）是H2Kd限制性CTL表位[22]。Liu等利用BIMAS軟件預測FMDV AF/72結構蛋白VP1的H2d限制性T細胞候選表位，并且化學合成這些候選表位，然后用表達FMDV AF/72結構蛋白VP1免疫小鼠，將分離的免疫后小鼠脾淋巴細胞與候選表位體外共培養，采用T細胞增殖試驗和IFN ELISPOT試驗進行驗證，結果表明pK1 （AYHKGPFTRL）是H2Kd限制性T細胞表位pD7 （GFIMDRFVKI）是H2Dd限制性T細胞表位[23]。Gao等使用MetMHCpan2.0和GENETYX預軟件預測的O型FMDV結構蛋白VP1上的T細胞候選表位化學合成后，用脂質體包裹來免疫小鼠，并進行T細胞增殖試驗、流式細胞術、IFN ELISA、CTL 試驗、豚鼠免疫保護力試驗及組織病理學觀察，結果表明肽段VP126–34（ RRQHTDVSF）和VP157–165（RTLPTSFNY）是O型FMDV的CTL表位，并且用其免疫動物可在一定程度上抵御口蹄疫病毒的攻擊[24]。

安徽農業科學2015年

但是，計算機預測表位也有諸多局限性，比如預測蛋白構象及表位遞呈過程等都是極其復雜的問題，需要累積大量的試驗數據，并且理論預測和實際情況總有一定差距。這就需要將2種或者多種以上的預測方法結合起來，以提高表位預測的準確率。該研究使用了5種預測軟件，結合多種算法，綜合考慮各個軟件的預測結果，最終選出10條候選表位。

CTL表位主要是由8～11個氨基酸殘基構成的線性表位。CTL表位是由內源性抗原在胞漿加工產生。內源性抗原是在細胞內產生和加工的蛋白，主要是細胞自身產生的蛋白、感染病毒或者細菌的細胞內產生的非細胞自身的蛋白和腫瘤蛋白等。蛋白酶體處理經泛素化后的內源性抗原，將其裂解成8～11個左右氨基酸殘基的肽段，再經過轉運蛋白（TAP）的作用進入內質網，與內質網上的MHCⅠ類分子上的抗原結合槽結合形成MHCⅠ抗原肽復合物。然后，通過高爾基體轉運到細胞膜表面，同CD8+T細胞上的TCR識別與結合，從而誘發CTL效應。因此CTL表位要有一定的穩定性，才能保證在整個加工、結合、遞呈和識別過程的順利進行，起到誘發細胞免疫的效應。因此，采用ProtParam軟件對候選表位進行穩定性分析。結果表明，pK1、pK4、pD2、pD4和pD5 的不穩定指數較高，分別為44.00、68.57、42.26、51.69和43.31。因此，這5個候選表位可能不是CTL表位。

動物機體是一個復雜的、受多因素影響的、不斷變化著的環境。筆者對候選表位所進行預測是在體外根據已知的細胞表位的各種理化數據、氨基酸殘基出現的頻率等多種因素來進行分析，其穩定性則是根據各個氨基酸殘基理化性質來分析。因此，預測分析的候選表位可能與實際情況存在差異，還需要進行體內外試驗來鑒定。

該研究借助于計算機表位預測軟件和蛋白質穩定性分析軟件來預測和分析口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株結構蛋白VP1上可能存在的H2d限制性T表位，結果表明有5條候選表位可能是CTL 表位，包括H2Kd限制性表位2條（第2735、118126位）、 H2Ld 限制性表位1條（第4351位），以及H2Dd 限制性表位2條（第4553、146154位）。當然，該研究預測的表位還需要體內外試驗來驗證。

參考文獻

[1]

DOEL T R.FMD vaccines.[J].Virus Res，2003，91（1）：81-99.

[2] BERGMANN I E，MALIRAT V，NEITZER T E，et al.Improvement of a serodiagnostic strategy for foot-and-mouth disease virus surveillance in cattle under systematic vaccination：a combined system of an indirect ELISA-3ABC with an enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay[J].Arch Virol，2000，145（3）：473-489.

[3] DE DIEGO M，BROCCHI E，MACKAY D，et al.The non-structural polyprotein 3ABC of foot-and-mouth disease virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle[J].Arch Virol，1997，142（10）：2021-2033.

[4] SANZPARRA A，JIMENEZCLAVERO M A，GARCIABRIONES M M，et al.Recombinant viruses expressing the foot-and-mouth disease virus capsid precursor polypeptide （P1） induce cellular but not humoral antiviral immunity and partial protection in pigs[J].Virology，1999，259（1）：129-134.

[5] MAYR G A，CHINSANGARAM J，GRUBAN M J.Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate J].Virology，1999，263（2）：496-506.

[6] SANZPARRA A，VAZQUEZ B，SOBRINO F，et al.Evidence of partial protection against foot-and-mouth disease in cattle immunized with a recombinant adenovirus vector expressing the precursor polypeptide （P1） of foot-and-mouth disease virus capsid proteins[J].J Gen Virol，1999，80 （Pt3）：671-679.

[7] MORAES M P，MAYR G A，MASON P W，et al.Early protection against homologous challenge after a single dose of replicationdefective human adenovirus type 5 expressing capsid proteins of foot-and-mouth disease virus （FMDV） strain A24[J].Vaccine，2002，20（11/12）：1631-1639.

[8] BHASIN M，LATA S，RRAGHAVA G P.Searching and mapping of T-cell epitopes，MHC binders，and TAP binders[J].Methods Mol Biol，2007，409：95-112.

[9] LUNDEGAARD C，LAMBERTH K，HARNDAHL M，et al.NetMHC-3.0：accurate web accessible predictions of human，mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11[J].Nucleic Acids Res，2008，36：509-512.

[10] LUNDEGAARD C，NIELSEN M，LUND O.The validity of predicted T-cell epitopes[J].Trends Biotechnol，2006，24（12）：537-538.

[11] NIELSEN M，LUNDEGAARD C，BLICHER T，et al.Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations[J].Protein Sci，2003，12（5）：1007-1017.

[12] BUUS S，LAUEMOLLER S L，WORNING P，et al.Sensitive quantitative predictions of peptide-MHC binding by a ‘Query by Committee artificial neural network approach[J].Tissue Antigens，2003，62（5）：378-384.

[13] PETERS B，SETTE A.Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method[J].BMC Bioinformatics，2005，6： 132.

[14] KIM Y，SIDNEY J，PINILLA C，et al.Derivation of an amino acid similarity matrix for peptide：MHC binding and its application as a Bayesian prior.[J].BMC Bioinformatics，2009，10：394.

[15] SIDNEY J，ASSARSSON E，MOORE C，et al.Quantitative peptide binding motifs for 19 human and mouse MHC class I molecules derived using positional scanning combinatorial peptide libraries[J].Immunome Res，2008，4：2.

[16] MOUTAFTSI M，PETERS B，PASQUETTO V，et al.A consensus epitope prediction approach identifies the breadth of murine T（CD8+）-cell responses to vaccinia virus[J].Nat Biotechnol，2006，24（7）：817-819.

[17] HOOF I，PETERS B，SIDNEY J，et al.NetMHCpan，a method for MHC class I binding prediction beyond humans[J].Immunogenetics，2009，61（1）：1-13.

[18] NIELSEN M，LUNDEGAARD C，BLICHER T，et al.NetMHCpan，a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and-B locus protein of known sequence[J].PLoS One，2007，2（8）：796.

[19] ZHANG H，LUND O，NIELSEN M.The PickPocket method for predicting binding specificities for receptors based on receptor pocket similarities：application to MHC-peptide binding[J].Bioinformatics，2009，25（10）：1293-1299.

[20] KAROSIENE E，LUNDEGAARD C，LUND O，et al.NetMHCcons：A consensus method for the major histocompatibility complex class I predictions[J].Immunogenetics，2012，64（3）：177-186.

[21] GAO F S，FANG Q M，LI Y G，et al.Reconstruction of a swine SLA-I protein complex and determination of binding nonameric peptides derived from the foot-and-mouth disease virus[J].Vet Immunol Immunopathol，2006，113（3/4）：328-338.

[22] BARFOED A M，RODRIGUEZ F，THERRIEN D，et al.DNA immunization with 2C FMDV non-structural protein reveals the presence of an immunodominant CD8+，CTL epitope for Balb/c mice[J].Antiviral Res，2006，72（3）：178-189.

[23] LIU X S，WANG Y L，ZHANG Y G，et al.Identification of H-2d restricted T cell epitope of foot-and-mouth disease virus structural protein VP1[J].Virol J，2011（8）：426.

[24] GAO F S，FENG L，ZHANG Q，et al.Immunogenicity of two FMDV nonameric peptides encapsulated in liposomes in mice and the protective efficacy in guinea pigs[J].PLoS One，2013，8（7）：68658.