采收期對阿克蘇地區灰棗cAMP含量的影響研究

史洪君　劉琦　孟瀟等

摘要[目的] 研究測定灰棗cAMP含量的新方法及灰棗采收期對其cAMP含量的影響。[方法]以阿克蘇地區灰棗為研究對象，建立了HPLC法測定灰棗中cAMP含量的定量測定方法，并對不同采收時期的灰棗及其制干產品的cAMP含量進行了測定。[結果]試驗表明，HPLC測定cAMP含量的色譜條件為：選用Inertsil ODS3色譜柱（4.6×250×5 μm）、以10%甲醇-90%的濃度為0.167 8%甲酸溶液為流動相、柱溫30 ℃、流速 0.8 ml/min、檢測波長254 nm測定灰棗中的cAMP含量，cAMP濃度在1.0～100.0 μg/ml范圍內與峰面積具有良好的線性關系，R2=0.999 0，且其精密性高、重現性好、加標回收率高（>98%， RSD值為1.38%）。灰棗采收時期對鮮棗及其制干產品的cAMP含量有顯著影響（達到0.01顯著水平）。

[結論]阿克蘇地區灰棗在10月24日至10月31日期間采收，有利于保持較高的cAMP含量，此期采收的鮮灰棗及其干棗的cAMP含量分別為75.237和294.097 μg/g左右。 研究可為新疆阿克蘇地區紅棗產業化發展提供科學參考。

關鍵詞灰棗；采收時間；環磷酸腺苷；HPLC

中圖分類號S665.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）16-291-03

Influence of Harvest Time of Huizao Jujube on Their Content of cAMP in Aksu Area

SHI Hongjun， LIU Qi， MENG Xiao， XIANG Yanju*

（College of Life Science， Tarim University/ Xinjiang Production & Construction Corp Key Laboratory for Advanced Processing of Local Agricultural Products in Southern Xinjiang， Alar， Xinjiang 843300）

Abstract[Objective] To develop new method for determination of cAMP content in Huizao jujube， and study effects of harvest time on cAMP content. [Method] With Huizao jujube in Aksu area as research object， the HPLC method was established for determination of cAMP content， cAMP content in Huizao jujube and its dried products in different harvest time was determined. [Result] The results as follows： the appropriate method with HPLC， were using Inertsil ODS3 column（4.6×250×5 μm）at 30 ℃ as stationary phase， using solution composed of methanol0.167 8% formic acid （10∶90）as mobile phase， detection wavelength at 254 nm， and flow rate with 0.8 ml/min. There was a good linear relationship between the concentration of cAMP and area integral value in the range of 1.0-100.0 μg/m， R2=0.999 0. The average recovery was over 98.0% with RSD=1.38. There was significant impact at 0.01 significant level between harvest time of Huizao jujube and their content of cAMP in fresh and dry fruits in Aksu Area.

[Conclusion] The appropriate harvest time was on between October 24 and 31 to obtain higher content of cAMP in Aksu Area， which was 75.237， 294.097 μg/g or so respectively. The study can provide scientific reference for Huizao jujube industrial development in Aksu Area.

Key wordsZizyphus jujube cv. Huizao； Harvest time； Adenosine cyclic 3，5monophosphate； HPLC

基金項目塔里木大學校長基金（TDZKSS201421）；國家級大學生創新訓練項目（201410757013）。

灰棗（zizyphus jujube cv.huizao）質地致密，可溶性固形物含量高（達30%），可食率97%以上，屬于優質的鮮食兼制干品種。灰棗自20世紀70年代初從河南新鄭引種到新疆，已成為新疆發展紅棗產業的主導品種，也是阿克蘇地區紅棗主栽品種[1]。該區灰棗水分含量低，總糖含量高，含有豐富的VC、環磷酸腺苷（cAMP）及必需氨基酸，營養價值高[2]。灰棗中不僅含有豐富的營養成分，更含有極為豐富的生物活性成分，cAMP 就是其中之一。臨床醫學研究證明，cAMP 能舒張平滑肌、擴張血管、改善肝功能、激活蛋白，并對心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癬等疾病有顯著療效[3]。棗中cAMP含量的檢測方法多是采用高效液相色譜法[4-6]。蒲云峰等用HPLC法測定了駿棗、冬棗、灰棗、葫蘆棗的cAMP含量，發現不同品種間cAMP含量差異較大，以灰棗含量最高，為（0.450±0.047）mg/g[7] 。而現有HPLC法測定cAMP含量時，使用的流動相極大多數為甲醇和一定濃度的磷酸二氫鉀水溶液。

除鮮食棗在脆熟期采收外，晾制干棗的都要在完熟期采收[8]。陳德廷等研究發現，不同采收期對商品干棗的單果重、棗果等級、商品干棗的產量、質量和經濟效益影響極大[9]。史彥江等對環塔里木盆地的駿棗的適宜采收期進行研究，結果表明，棗果干物質積累隨采收期的延遲表現出先增加后停止的現象；其總糖含量和糖酸比，在10月5日時達最高值，其后呈降低趨勢，而總酸含量則隨采收期的延遲基本表現遞增的現象；不同地區的駿棗采收期有所不同，新疆于田縣試點及其相似區域，駿棗適宜采收期在10月15日左右，而新疆阿克蘇市、新和縣試點及其相似區域，適宜采收期宜則在10月20日左右[10]。

筆者以阿克蘇地區灰棗為研究對象，研究利用HPLC法測定灰棗cAMMP含量的新方法，并就灰棗采收期對其cAMP含量的影響進行研究，以期為該地區紅棗產業化發展提供科學參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試原材料。灰棗，采自塔里木大學校辦農場4年生灰棗園。采收時期：自9月19日始，每隔6～7 d采果一次，至11月7日止，共采棗8次，采棗時間為18：00左右。采收方法：選健壯、豐產的棗樹20棵，在每株樹上分不同時期采收鮮棗，每次每株采40個棗果，采收時在所選的棗樹上打好標記，并固定枝條作為采收枝。首次采收時，從枝條頂部第1個二次枝采摘，每間隔5～6個二次枝采摘1個二次枝上的所有棗果，依此類推。后期采摘樹上所標枝條棗果不足時，從對應枝樹下拾取不足部分。采后的棗及時置于4～5 ℃冷庫中預冷。

干制灰棗：按GBT 5835-2009 干制紅棗執行。將采后經預冷的灰棗于50 ℃恒溫鼓風干燥箱中干燥，至其水分含量在22%～25%時干燥終止。

1.1.2主要試劑。

cAMP標準品（純度>99%），Ruibio進分，合肥博美生物科技有限責任公司；

甲醇（純度=99.9%），色譜純，SigmaAldrich；甲酸，分析純，天津市富寧精細化工有限公司；

娃哈哈飲用純凈水，石河子娃哈哈食品有限公司。

1.1.3主要儀器。

島津LC20A高效液相色譜儀，日本島津制作所；FA2104N電子天平，上海菁海儀器有限公司；KQ3200DV型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GL20GII 型超速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；UPSⅢ10T優惠超純水制造系統，成都超純水科技有設公司；GZX9420MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司。

1.2方法

1.2.1紅棗cAMP提取樣液制備方法。

1.2.1.1鮮棗cAMP提取樣液制備方法。

準確稱取鮮棗5 g，去皮去核后放入研缽研磨至勻漿，然后加入30 ml超純水將其全部轉移至三角瓶中，超聲提取30 min后，4 800 r/min離心30 min，取上清液。殘渣重復提取一次（加入20 ml超純水），合并2次提取的上清液，移入容量瓶定容至50 ml，于4 ℃冰箱冷藏備用。將棗樣液過0.45 μm針式濾頭得使用液，注入樣品瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.1.2干棗cAMP提取樣液制備方法。

準確稱取鮮棗2 g，去皮去核后放入研缽研磨至勻漿，然后加60 ml超純水將其全部轉移至三角瓶中，超聲提取30 min后，4 800 r/min離心30 min，取上清液。殘渣重復提取一次（加入40 ml超純水），合并2次提取的上清液，移入容量瓶定容至100 ml，于4 ℃冰箱冷藏備用。將棗樣液過0.45 μm針式濾頭得使用液，注入樣品瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.2標準品溶液的配制。

1.2.2.1標準品儲備液的配制。

準確稱取0.012 9 g環磷酸腺苷標準品，用超純水定容至10 ml，得1.29 mg/ml的cAMP標準品貯備液。

1.2.2.2標準品使用液的配制。

精確吸取0.387 597 ml環磷酸腺苷標準品貯備液于5 ml容量瓶中，用超純水定容至5 ml，得100 μg/ml標準溶液使用液；再依次從制得的100、50、10、5、2 μg/ml標準溶液使用液中吸取2.5、1.0、2.5、2.0、2.5 ml于5 ml容量瓶中并定容，制得50、10、5、2 和1.0 μg/ml標準溶液使用液。濾液于4 ℃冰箱冷藏，用前過0.45 μm針式濾頭。

1.2.3色譜條件。

色譜柱：Inertsil ODS3，4.6×250×5 μm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 ml/min；波長：254 nm；進樣量：10 μl；流動相A：10%色譜甲醇，流動相B：90%的濃度為0.167 8%的甲酸溶液（即將1 ml甲酸溶于一瓶容積為596 ml的娃哈哈純凈水）。

1.2.4方法測試。

按照上述色譜條件，將濃度為5、10 μg/ml的處理好的cAMP標準品溶液放入自動進樣器，掃描結果見圖1和圖2。從圖1～2可知，cAMP標準品在保留時間為14.445 min時有最大吸收峰出現，且該峰隨濃度增加，吸收峰高度及峰面積也增加，表明利用此法測定cAMP含量時其保留時間為14.445 min。

圖15 μg/ml cAMP標準品的HPLC色譜

圖210 μg/ml cAMP標準品的HPLC色譜

1.2.5棗中cAMP含量的計算公式。計算公式如下：

X=C×V/M

式中，X為待測紅棗樣品的cAMP含量（μg/g）；

C為 HPLC法測得的紅棗cAMP提取樣液中的cAMP濃度（μg/ml）；

V為制備紅棗cAMP提取樣液時定容的體積（ml）；

M為紅棗的質量（g）。

2結果與分析

2.1標準曲線的建立

分別吸取10 μl cAMP 標準使用液，注入高效液相色譜儀，測定其峰面積。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得圖3，并計算得回歸方程y=28 159x-19 592，R2=0.999 0。

圖3cAMP 標準曲線

2.2精密性試驗

將制備的紅棗樣品溶液過0.45 μm濾膜后放入樣品瓶中，準確量取紅棗樣品溶液10 μl，用HPLC法測定其峰面積，從而確定cAMP含量。連續進樣測定5次，結果見表1。計算得其RSD值為0.105 0%，表明該方法精密性良好。

表1精密度試驗

試驗號測提樣品液的峰面積樣液中cAMP含量∥μgcAMP含量平均值∥μgRSD%

1862 16831.3131.490.105 0

2866 98031.48

3868 43731.53

4869 59131.57

5868 84531.55

2.3重現性試驗

將制備的紅棗樣品溶液貯藏于4 ℃冰箱中，6 d后取出，過0.45 μm濾膜后，分別量取1.5 ml置于5個樣品瓶中；再準確量取紅棗樣品溶液10 μl，用HPLC法測定其峰面積，以確定cAMP含量，結果見表2。計算得其RSD值為1.78%，表明該方法重復性好。

表2重現性試驗

試驗號測提樣品液的峰面積樣液中cAMP含量∥μgcAMP含量平均值∥μgRSD%

1749 69927.3230.471.78

2874 49831.75

3854 06631.02

4858 00931.16

5856 87431.12

2.4回收率試驗

將已經測定了含量的紅棗樣品過0.45 μm的濾膜后，精密量取 1 ml置于5 個樣品瓶中，再加入濃度為10 μg/ml 的cAMP標準品溶液 1 ml，搖勻后，進樣 10 μl，HPLC測定峰面積，計算回收率，結果見表3。由表3可知，用此色譜條件測定cAMP含量，其回收率超過98%，回收率RSD值為1.38%，表明該方法測定 cAMP含量時的回收率較好，方法可行。

表3加標回收率試驗結果

試驗號樣液中cAMP含量∥μgcAMP加入量∥μgcAMP測定量∥μg回收率∥%平均回收率∥%RSD∥%

131.481041.2898.098.061.38

231.481041.3598.7

331.481041.2097.2

431.481041.1296.4

531.481041.48100

2.5采收期對灰棗及其干制品cAMP含量的影響

將樣品使用液按照“1.2.3”的色譜條件測定其含量，并按“1.2.5”中公式計算棗中的cAMP含量，結果見圖4。

圖4灰棗采收期對其cAMP含量的影響

由圖4可知，阿克蘇地區所產灰棗，自9月20日起至11月7日止，其鮮棗中cAMP含量在25.20～78.024 μg/g。在10月24日前隨著采收期的延遲，其含量逐漸升高，但在10月24日后其含量變化不大；而不同采收期的灰棗經干制后，其含量先逐漸升高，到10月24達到最高值294.097 μg/g，隨后再逐漸降低。從不同采收期的鮮棗及制干后干棗的cAMP含量來看，阿克蘇地區灰棗以10月24日至10月31日期間采收，有利于保持較高的cAMP含量。

經對采收時間、鮮棗的cAMP含量和干棗的cAMP含量進行相關性分析，結果見表4。由表4可知，采收時間對鮮棗的cAMP含量和干棗的cAMP含量的影響，以及鮮棗的cAMP含量與干棗的cAMP含量之間都達到0.01極顯著相關水平。

表4采收時間、鮮棗的cAMP含量、干棗的cAMP含量三者間的相關性

項目采收時間鮮棗的cAMP含量干棗的cAMP含量

采收時間10.969**0.838**

鮮棗的cAMP含量0.969**10.931**

干棗的cAMP含量0.838**0.931**1

注：**表示在0.01水平（雙側）上顯著相關。

43卷16期

史洪君等采收期對阿克蘇地區灰棗cAMP含量的影響研究

3結論

通過試驗，獲得了HPLC測定cAMP含量的色譜條件為：選用Inertsil ODS3色譜柱（4.6×250×5 μm）、以10%甲醇-90%的濃度為0.167 8%甲酸溶液為流動相、柱溫30 ℃、流速 0.8 ml/min、檢測波長254 nm測定灰棗中的cAMP含量，cAMP濃度在1.0～100.0 μg/ml范圍內與峰面積具有良好的線性關系，R2=0.999 0，且其精密性高、重現性好及加標回收率高（>98%，RSD值為1.38%）。

紅棗采收時期對鮮棗及制干后干棗的cAMP含量有顯著影響（達到0.01極顯著水平）；阿克蘇地區灰棗在10月24日至10月31日期間采收，有利于保持較高的cAMP含量，此期采收的鮮灰棗cAMP含量在75.237 μg/g左右，制得的干棗cAMP含量在294.097 μg/g左右。

參考文獻

[1] 牛攀新，袁火霞，楚光明.新疆南疆地區灰棗矮、密、早豐產栽培技術[J].北方園藝，2009（12）：155-157.