不同光質(zhì)對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖及有效成分含量的影響

林小蘋 賴鐘雄

摘 ?要 ?以鐵皮石斛的原球莖、無根苗（無根試管苗）、莖段和葉片為材料，研究不同光質(zhì)條件對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖及4種材料中多糖和生物堿含量的影響。結(jié)果表明，在綠光下原球莖的增長(zhǎng)率明顯低于其他光質(zhì)，在白光和藍(lán)光下原球莖的增長(zhǎng)率較好;在4種材料中，藍(lán)光能促進(jìn)生物堿的合成，有利于生物堿積累，而紅光能促進(jìn)碳水化合物的積累，有利于多糖含量增加，綠光則不同程度地抑制多糖和生物堿的積累。

關(guān)鍵詞 ?鐵皮石斛;光質(zhì);原球莖增殖;有效成分含量

中圖分類號(hào) ?R282;R931 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Effect of Light Quality on the Proliferation of Protocorm and

Active Ingredient Contents of Dendrobium officinale

LIN Xiaoping1，2， LAI Zhongxiong2 *

1 Zhangzhou City Professional College， Zhangzhou， Fujian 363000， China

2 Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?The protocorms， plantlets（without roots）， stem segments and leaves were used as the materials for messuring the proliferation of protocorm， polysaccharide content and alkaloid content in different light quality in Dendrobium officinale. The results showed that the proliferation of protocorm in green light condition was significantly lower than those of other groups， while that was better in white and blue light condition; Blue light could promote the synthesis of alkaloids and was advantageous to the alkaloid accumulation; Red light could promote the accumulation of carbohydrates and was advantageous to the polysaccharide content increased; Green light in different degrees suppressedf polysaccharide and alkaloid accumulation in the four materials.

Key words ?Dendrobium officinale; Light quality; Proliferation of protocorm; Active ingredients ?content

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.012

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材之一，含有多糖、生物堿等多種人體所需的有益成份。目前，鐵皮石斛的組織培養(yǎng)普遍采用日光燈為光源，其光譜有很多植物生長(zhǎng)不必要的波長(zhǎng)并存在發(fā)熱浪費(fèi)能源等問題。光照是植物生長(zhǎng)的主要影響因素之一，其中光質(zhì)對(duì)植物的光形態(tài)建成起著重要而復(fù)雜的調(diào)控作用。由于光調(diào)控的復(fù)雜性及次生代謝產(chǎn)物形成和積累的特異性，使同一個(gè)體不同部位及發(fā)育時(shí)期次生代謝產(chǎn)物的含量具有一定的差異性。多名學(xué)者對(duì)多糖及生物堿在鐵皮石斛中分布規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛有效成分含量的多少與其培養(yǎng)的不同階段和取材部位有關(guān)。除了石斛傳統(tǒng)的入藥部位——莖外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)石斛類植物原球莖、根和葉中也含有較高的多糖及生物堿[1-8]。因此，通過探究不同光質(zhì)條件下鐵皮石斛生長(zhǎng)及生物堿和多糖含量的變化，確定促進(jìn)鐵皮石斛生長(zhǎng)及體內(nèi)有效成分含量增加的最佳光質(zhì)，對(duì)研究石斛類植物具有重要的意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

在白光（W）、紅光（R）、藍(lán)光（B）和綠光（G）4種不同光質(zhì)下培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖及試管苗。光照使用的各種光源均系冷光源，主要技術(shù)參數(shù)見表1。每天光照15 h，培養(yǎng)溫度：25 ℃。

1.2 ?方法

1.2.1 ?不同光質(zhì)對(duì)原球莖增殖的影響 ? 以鐵皮石斛原球莖為材料，每瓶接入5團(tuán)原球莖，每個(gè)處理10瓶，3次重復(fù)。每20 d測(cè)定1次鮮重，按以下公式計(jì)算增殖率。

增殖率=[（培養(yǎng)后的鮮重-接種時(shí)的鮮重）/接種時(shí)的鮮重]×100%

1.2.2 ?不同光質(zhì)對(duì)試管苗生長(zhǎng)的影響 ? 以鐵皮石斛長(zhǎng)約0.5～1 cm的莖段為材料，每瓶接10個(gè)莖段，常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)40 d后，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的芽苗轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，放在不同光質(zhì)條件下培養(yǎng)，每瓶接10個(gè)芽苗，每個(gè)處理5瓶，3次重復(fù)。

株高（莖基部到莖最高點(diǎn)）、最大葉寬（每株最大葉的最寬處）和最大葉長(zhǎng)（每株最大葉的最長(zhǎng)處）用游標(biāo)卡尺測(cè)量，精度0.001 cm;數(shù)據(jù)分析運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行單因素方差分析，葉片顏色、健壯度、長(zhǎng)勢(shì)等外部形態(tài)特性用描述法。

1.2.3 ?不同光質(zhì)對(duì)多糖含量的影響 ? 參照李彩霞等[9]的方法，提取在不同光質(zhì)條件下培養(yǎng)60 d的鐵皮石斛原球莖、無根苗（無根試管苗）、莖和葉4種材料的多糖，測(cè)定其百分含量。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、40、60、80和100 μL，分別置10 mL容量瓶中，加蒸餾水至2.0 mL，各加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，25 ℃水浴放置25 min。另以2 mL蒸餾水同法操作作為空白對(duì)照。于490 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為C=144.85A-0.306 1（R2=0.999 6）。葡萄糖在6.36～25.49 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

（2）樣品溶液制備與測(cè)定。精確稱取樣品約0.5 g（精確度0.001 g），放入50 mL容量瓶中，加30 mL蒸餾水，超聲波（功率120 W，頻率40 kHz）處理20 min后定容至刻度。自然沉淀1 h，取上清液2 mL，加無水乙醇8 mL，混勻放置0.5 h。離心機(jī)3 000 r/min離心20 min。棄上清液，沉淀加蒸餾水混勻，定容至25 mL備用。吸取備用液0.5 mL，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同法操作，490 nm處測(cè)定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品溶液中葡萄糖含量（μg）。再按下式計(jì)算樣品中多糖的百分含量。

X=■×100%

式中X為樣品中多糖的百分含量;V1為樣品定容體積（mL）;V2為樣品定溶液取樣體積（mL）;V3為沉淀定容體積（mL）;V4為測(cè)定用樣液體積（mL）;W為樣品重量（g）;C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品溶液中葡萄糖含量（μg）。

1.2.4 ?不同光質(zhì)對(duì)生物堿含量的影響

（1）樣品生物堿提取。取在不同光質(zhì)條件下培養(yǎng)60 d的鐵皮石斛原球莖、無根苗（無根試管苗）、莖和葉4種材料，50 ℃烘干備用。取樣品粗粉0.5 g于平底燒瓶中，加入適量濃氨水潤(rùn)濕，密封放置30 min后加入10 mL氯仿，稱重后放入水浴鍋中加熱回流2 h，冷卻后再次稱重并補(bǔ)充氯仿至原重，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，用氯仿定容到10 mL，搖勻，從中吸取2 mL，加氯仿定容至25 mL，搖勻，即為樣品待測(cè)液。同時(shí)，取石斛堿標(biāo)準(zhǔn)溶液（25 μg/mL）2 mL，加氯仿定容至25 mL，搖勻，即為生物堿標(biāo)準(zhǔn)液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。參考金蓉鸞等[10]的試驗(yàn)步驟，采用溴甲酚綠酸性染料比色法，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以石斛堿標(biāo)準(zhǔn)液的不同濃度為橫坐標(biāo)，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：A=0.075 5C+0.001（R2=0.999 7）。生物堿含量在1～5 μg/mL范圍內(nèi)符合比爾定律。

（3）樣品生物堿含量測(cè)定。精確移取樣品待測(cè)液各10 mL，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同法操作，620 nm處測(cè)定吸光度。按以下公式計(jì)算總生物堿含量。

總生物堿含量=■×100%

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同光質(zhì)對(duì)原球莖增殖的影響

由圖1可見，不同光質(zhì)下鐵皮石斛原球莖的生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，綠光下各個(gè)階段的增長(zhǎng)率要明顯低于其他3種光質(zhì)。0～20 d為延遲期，這個(gè)時(shí)期的原球莖要適應(yīng)新的環(huán)境，所以增長(zhǎng)速度較為緩慢，不同光質(zhì)之間沒有明顯區(qū)別。40～80 d，除綠光外，其他3種光質(zhì)下的原球莖分裂旺盛，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，較快進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。其中，藍(lán)光和白光下原球莖增殖率沒有較明顯的差異，紅光居中，而綠光從60 d起才有一個(gè)明顯的增長(zhǎng)過程，增長(zhǎng)率也較其他3種光質(zhì)低。80 d后，藍(lán)光和綠光下原球莖的生長(zhǎng)進(jìn)入靜止期，原球莖細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和增生減緩，趨于平穩(wěn)，100 d后生長(zhǎng)進(jìn)入衰老期，而白光和紅光下的原球莖仍有較緩慢的增長(zhǎng)趨勢(shì)。這說明藍(lán)光在原球莖增長(zhǎng)指數(shù)生長(zhǎng)期有明顯的促進(jìn)作用，到靜止期后作用減弱甚至有抑制作用，而紅光和白光對(duì)原球莖的增長(zhǎng)雖然沒有藍(lán)光那么強(qiáng)的促進(jìn)作用，但作用時(shí)間長(zhǎng)，從整體的量上來說三者是持平的。

2.2 ?不同光質(zhì)對(duì)試管苗生長(zhǎng)性狀的影響

2.2.1 ?不同光質(zhì)對(duì)試管苗株高的影響 ? 運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行不同光質(zhì)下試管苗株高的單因素方差分析，結(jié)果顯示p值為0.000 1（表2），小于0.05，說明不同光質(zhì)處理對(duì)鐵皮石斛試管苗的株高具有顯著性差異。

從表3的Tukey多重比較可看出，藍(lán)光與紅光和綠光處理之間的差距較大，平均株高變幅為2.046 3～5.318 7 cm，紅光下的最矮，藍(lán)光下的最高。紅光和綠光下的差距較小。

2.2.2 ?不同光質(zhì)對(duì)試管苗葉長(zhǎng)的影響 ? 運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行不同光質(zhì)下試管苗葉長(zhǎng)的單因素方差分析，結(jié)果顯示p值為0.000 1（表4），小于0.05，說明不同光質(zhì)處理對(duì)鐵皮石斛試管苗的葉長(zhǎng)具有顯著性差異。

從表5的Tukey多重比較看出，最大葉長(zhǎng)的變幅為1.03～3.99 cm，藍(lán)光與其他光質(zhì)處理之間的差距較大，紅光和綠光下的差距較小。

2.2.3 ?不同光質(zhì)對(duì)試管苗葉寬的影響 ? 運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行不同光質(zhì)下試管苗葉寬的單因素方差分析，結(jié)果顯示p值為0.000 1（表6），小于0.05，說明不同光質(zhì)處理對(duì)鐵皮石斛試管苗的葉寬均具有顯著性差異。

從表7的也可看出，綠光與其他光質(zhì)處理差距較大，葉片最細(xì)，白光處理最寬。

2.2.4 ?不同光質(zhì)對(duì)試管苗性狀的影響 ? 不同光質(zhì)下鐵皮石斛試管苗的外觀表現(xiàn)差異顯著（見表8）。結(jié)合葉色、健壯度等外觀表現(xiàn)，白光下的優(yōu)勢(shì)比較明顯，表現(xiàn)為葉色濃綠，莖粗壯;藍(lán)光下的莖雖然粗稍遜于白光下的，但株高比白光下的高，葉片也較長(zhǎng)，說明藍(lán)光在一定程度上有利于鐵皮石斛的長(zhǎng)高及葉片的縱向生長(zhǎng)，但白和藍(lán)2種光質(zhì)對(duì)叢生芽的增殖效果較弱;而紅光抑制植株的長(zhǎng)高但有利于莖的橫向加粗及側(cè)芽的形成，萌蘗能力更強(qiáng);綠光雖然也能形成較多的小蘗苗，但形成的植株長(zhǎng)勢(shì)弱小，說明紅和綠2種光質(zhì)對(duì)叢生芽的增殖有促進(jìn)作用，有利于短期獲得大量的試管苗。

2.3 ?不同光質(zhì)對(duì)有效成分的影響

運(yùn)用DPS軟件對(duì)不同光質(zhì)下有效成分的含量進(jìn)行顯著性差異分析（表9）。從表9可以看出，不同光質(zhì)下鐵皮石斛有效成分含量存在顯著差異。白光和紅光下對(duì)無根苗和葉中生物堿含量的影響不顯著，不同顏色光照射，對(duì)原球莖和莖中生物堿含量的影響差異較大;白光或紅光照射，對(duì)無根苗中多糖含量的影響不顯著，紅光和藍(lán)光照射，對(duì)原球莖中多糖含量沒有顯著影響，而不同顏色光照射，對(duì)莖和葉中多糖含量則影響顯著。由表9還可見，生物堿對(duì)光質(zhì)的響應(yīng)趨勢(shì)與多糖基本一致： 原球莖、莖和葉中均是白光下的最高，綠光下的最低，無根苗中是紅光最高，綠光最低。

2.3.1 ?不同光質(zhì)對(duì)多糖含量的影響 ? 從圖2可以看出，在不同光質(zhì)下培養(yǎng)60 d后，4種材料內(nèi)多糖含量的百分比大多呈現(xiàn)出“原球莖≥無根苗>葉>莖”的趨勢(shì)，只有綠光下培養(yǎng)的材料，多糖含量的百分比趨勢(shì)稍有區(qū)別，以葉片中的多糖含量最少;白光下培養(yǎng)的材料，除無根苗多糖含量稍低于紅光下的外，其他3種材料均含量最高;綠光下培養(yǎng)的材料，多糖含量一直處于最低值，這說明白光和紅光對(duì)鐵皮石斛多糖合成有促進(jìn)作用，而綠光則有一定程度的抑制作用。

2.3.2 ?不同光質(zhì)對(duì)生物堿含量的影響 ? 從圖3可以看出，生物堿合成對(duì)光質(zhì)的響應(yīng)，表現(xiàn)為白光和藍(lán)光下的生物堿含量明顯較紅光和綠光下的高，說明適當(dāng)?shù)乃{(lán)光可以促進(jìn)生物堿的合成和積累，而綠光可能會(huì)減少生物堿合成前體物的供給，從而影響生物堿的合成，不利生物堿含量的積累。無論在何種光質(zhì)下，生物堿含量基本都呈現(xiàn)“原球莖≥莖>葉>無根苗”的大體趨勢(shì)，原球莖和莖中的生物堿含量較高。

3 ?討論與結(jié)論

3.1 ?光質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響

植物正常的發(fā)育過程是一個(gè)光形態(tài)建成的過程，植物通過體內(nèi)3種主要光受體：紅光和遠(yuǎn)紅光受體、藍(lán)光受體、紫外光受體來感知不同波長(zhǎng)的光信號(hào)，因此光質(zhì)對(duì)植物的光形態(tài)建成起著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。但是，光質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控又是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，不同組織或器官對(duì)同一種光質(zhì)的反應(yīng)不盡相同，表現(xiàn)出光質(zhì)生物學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性。本研究的結(jié)果表明，4種不同光質(zhì)下鐵皮石斛原球莖的生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，藍(lán)光對(duì)原球莖增長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，綠光下各個(gè)階段的增長(zhǎng)率要明顯低于其他3種光質(zhì);白光在促進(jìn)試管苗生長(zhǎng)方面有比較明顯的優(yōu)勢(shì)，藍(lán)光雖然稍遜于白光，但在株高及葉的長(zhǎng)勢(shì)方面均比白光的高，而紅和綠2種光質(zhì)對(duì)叢生芽的增殖有促進(jìn)作用，有利于短期獲得大量的試管苗。這與車生泉等[12]、潘新仿等[13]和梁學(xué)芬等[14]的研究結(jié)果基本一致。但與Moe等[15]、李韶山等[11]和賈書華[16]等的研究結(jié)果又有不同，他們的研究認(rèn)為光質(zhì)在抑制莖的伸長(zhǎng)方面，紅光與藍(lán)光都有顯著效果。究其原因，與光質(zhì)對(duì)植物體內(nèi)生長(zhǎng)素（如赤霉素、吲哚乙酸）的含量、吲哚乙酸氧化酶的活性、誘導(dǎo)原生質(zhì)體收縮反應(yīng)等因素有關(guān)。

3.2 ?光質(zhì)對(duì)有效成分合成的影響

影響植物體內(nèi)有效化合物含量的因素很多，如生長(zhǎng)狀態(tài)，光照、溫度和提取方法等內(nèi)、外因素。資料表明[7]，鐵皮石斛不同部位的生物堿含量各不相同，呈現(xiàn)莖上段>葉>莖中段≈莖下段的規(guī)律;而且不同干燥方法處理的鐵皮石斛，各部位的生物堿含量會(huì)發(fā)生了一定變化，與曬干處理相比較，殺青烘干處理的鐵皮石斛，莖上段和根部的石斛堿含量均下降，而莖中下段和葉等其他部位的生物堿含量則提高了。與光合產(chǎn)物多糖相比，生物堿作為一種次生代謝產(chǎn)物，分布有局限性，僅出現(xiàn)在某些特化的器官、組織或細(xì)胞中。在離體培養(yǎng)條件下，受內(nèi)外因素影響，不同部位的細(xì)胞或組織內(nèi)在生理生化特性發(fā)生相應(yīng)的變化，從而使細(xì)胞合成某種化合物的能力被激活或喪失，導(dǎo)致次生代謝含量產(chǎn)生提高或下降的變化。本試驗(yàn)中生物堿含量呈現(xiàn)“原球莖≥莖>葉>無根苗”這一趨勢(shì)的原因，是否與在鐵皮石斛的衰老死亡過程中，生物堿在不同部位會(huì)發(fā)生了運(yùn)輸轉(zhuǎn)移有關(guān)。

環(huán)境因子變化可誘發(fā)植物碳代謝途徑的轉(zhuǎn)變[17-20]，目前光質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)及有效成分含量的影響大家已經(jīng)達(dá)成一定的共識(shí)。有較多資料表明，光質(zhì)對(duì)高等植物的碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用。對(duì)番茄[21]、水稻[22]、水母雪蓮[23]、鐵皮石斛[24-25]、霍山石斛[16]等多種植物的研究發(fā)現(xiàn)，紅光能促進(jìn)植物體內(nèi)碳水化合物的積累，藍(lán)光能提高蛋白質(zhì)的含量。生物堿是植物體內(nèi)一種堿性的含氮有機(jī)化合物，而多糖是細(xì)胞中碳水化合物的一種。本試驗(yàn)結(jié)果也證明藍(lán)光能促進(jìn)生物堿的合成，有利于生物堿積累，而紅光能促進(jìn)植物體內(nèi)碳水化合物的積累，有利于多糖含量增加，綠光不同程度地抑制多糖和生物堿在植株中的積累，這與侯甲男[24]、高亭亭等[25]及賈書華[16]的研究結(jié)果是一致的。高建平等[26]通過免疫藥理的研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛原球莖與原藥材作用相似，均能提高機(jī)體的非特異性免疫功能和細(xì)胞免疫功能。本試驗(yàn)的研究表明，鐵皮石斛原球莖內(nèi)多糖及生物堿的含量均比試管苗高，這與張冬青等[27]、黃民權(quán)等[28]的結(jié)果也一致。這初步證明可以通過選擇合適的光質(zhì)來提高原球莖次生代謝產(chǎn)物的積累，以組織培養(yǎng)獲得的鐵皮石斛原球莖代替其野生品是解決鐵皮石斛資源緊缺的有效途徑。

近年來，光質(zhì)對(duì)鐵皮石斛試管苗農(nóng)藝性狀及有效成分的影響僅僅處于探究階段，還沒有真正在生產(chǎn)中應(yīng)用。在栽培實(shí)踐中，國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了一種新型轉(zhuǎn)光農(nóng)膜[29]，鐵皮石斛作為陰生植物，在大棚栽植階段能否用不同色膜覆蓋，在避雨和遮陽的同時(shí)提高鐵皮石斛的質(zhì)與量，也是一個(gè)可以進(jìn)行探究的問題。因此，利用鐵皮石斛組織培養(yǎng)體系，進(jìn)行不同光質(zhì)處理，探究如何提高其生長(zhǎng)速率和有效成分的積累，既可以直接用于鐵皮石斛制品的生產(chǎn)，也能指導(dǎo)鐵皮石斛的野外田間栽培，提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，以滿足不斷擴(kuò)大的市場(chǎng)需求，提高經(jīng)濟(jì)效益。

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