中國水仙NtSTK基因的克隆、序列和組織表達分析

吳菁華 吳少華 楊超 張志忠 林文雄

摘 ?要 ?MADS-box基因在植物花發育中發揮著重要的作用。為了研究D類MADS-box基因在中國水仙花發育中的功能，本實驗采用RACE和RT-PCR技術從中國水仙‘金盞銀臺中分離到1個MADS-box基因，命名為NtSTK。該基因含有1個705 bp的開放閱讀框，編碼234個氨基酸，并且該基因在3個不同類型的中國水仙中序列差異較小。系統進化樹顯示NtSTK屬于D類MADS-box基因。熒光定量分析表明該基因在‘金盞銀臺和‘玉玲瓏的雌蕊和子房中表達水平較高，在根和葉片中低水平表達，在花被和雄蕊及鱗莖中不表達。

關鍵詞 ?中國水仙;MADS-box基因;NtSTK基因;花發育

中圖分類號 ?S682.21 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

cDNA Cloning， Sequence Analysis and Tissue Expression

of NtSTK in Narcissus tazetta var. chinensis

WU Jinghua1， WU Shaohua1， YANG Chao1， ZHANG Zhizhong1， LIN Wenxiong2

1 College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Institute of Agroecology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract ?MADS-box genes play an important role in flower development. To investigate the function of D-class gene on flower development in Chinese narcissus， A MADS-box gene， named NtSTK， was cloned from‘Jinzhanyintaiflower buds by RACE and RT-PCR. The ORF of NtSTK is 705 bp in length that putatively encodes a protein with 234 amino acids. Sequence analysis indicated little differences among the three NtSTK genes cloned from Chinese narcissus. Homology analysis showed that the NtSTK was a D-class MADS-box gene. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that NtSTK was expressed higher levels in pistil and ovary from‘Jinzhanyintaiand‘Yulinglong， with low expression in leaf and root and no expression in perianth， stamen and bulb.

Key words ?Narcissus tazetta var. chinensis; MADS-box gene; NtSTK gene; Flower development

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.016

植物花器官發育近年來成為發育生物學研究的熱點，繼花發育ABC模型提出后，學者又不斷的進行補充和完善，提出了ABCDE模型[1-3]。此模型中基因大部分屬于MADS-box基因家族，該家族基因都具有MADS-box保守結構域，參與了多種植物生命活動，如調節植物開花時間[4]、花器官發育[5-6]、果實發育[7]、組織分化[8]和根、葉等營養器官的發育[9-10]。

到目前為止，在所有主要的種子植物中都發現有AGAMOUS基因（AG基因）。AG基因在被子植物和裸子植物分化之后、被子植物進化早期發生了一次重要的基因重復事件，產生了C類和D類基因，C類基因可進一步分為兩亞進化枝：euAG亞進化枝和PLENA亞進化枝[11-12]。根據ABCDE模型，B、C和E基因調控形成花瓣和雄蕊;C和E基因調控心皮形態發生;D和E基因是參與胚珠的發育。這些基因產物構成多聚體調控復合體通過識別目標基因特定的順式元件來調控花器官的發育[13-15]。

中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）是福建省的特色花卉，具有極高的觀賞和經濟價值。目前關于中國水仙花發育相關的報道較少[16-19]，主要集中在B類、C類和E類基因中，未見關于D類基因的報道。本研究以中國水仙3個品種為材料，利用RT-PCR結合RACE技術克隆STK基因，并對其表達模式進行了分析。本實驗為分析花發育ABCDE模型在單子葉植物中的適用性提供材料，同時也為闡明水仙花發育機理和利用分子生物學手段對水仙進行遺傳改良奠定理論基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

‘金盞銀臺和‘玉玲瓏來自于福建省漳州市的2個中國水仙品種，平潭水仙是來自于福建省平潭綜合實驗室的水仙種質。分別取花芽、葉片、鱗莖以及盛花期的花瓣、副冠、雄蕊和雌蕊，液氮處理后置于-80 ℃保存備用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?中國水仙NtSTK基因的克隆 ? 采用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取中國水仙‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙花蕾的RNA，用Clontech公司SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit合成cDNA。根據Genebank中單子葉植物STK類基因保守區序列設計特異引物，NtSTK1：5′-ATGGGGAGGGGAAAGA

TTGAGATAAAGAGG-3′，NtSTK2：5′-ACCCAAGA

TGAAGGGCTGTTTG-3′，以‘金盞銀臺cDNA為模板，進行PCR擴增，獲取中國水仙STK基因保守區序列。據此序列設計3′RACE引物，NtSTK3：5′-GCAGCAAAACTGCGCCATCAGATTCAG-3′，與試劑盒中的引物進行PCR擴增獲得該基因的3′端。根據上述實驗結果設計NtSTK基因ORF的上游引物NtSTK4：5′-TATGAGCTCATGGGGAGGGGAAAG

ATT-3′和下游引物NtSTK5：5′-CTGTCTAGATCA

TTCTTCAGGATCAGCTT-3′，分別以‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙cDNA為模板進行PCR擴增，獲得各品種的NtSTK基因ORF。

1.2.2 ?序列的生物信息學分析 ? 利用ExPASY系統中的ProtParam工具（http：//www.expasy. org/tools/ protparam.html）對水仙STK基因編碼氨基酸進行分析，運用Blast搜索同源基因，使用Mega5軟件對搜索獲得的基因進行多重序列比對，構建系統發生樹。

1.2.3 ?NtSTK基因的表達分析 ? 分別提取單瓣水仙‘金盞銀臺的花瓣、副冠、雄蕊、雌蕊、葉片、根、鱗莖、子房和重瓣水仙‘玉玲瓏的花瓣、副冠、瓣化雄蕊、瓣化雌蕊的總RNA，測定OD值后，取相同量RNA逆轉錄成cDNA，稀釋10倍后待用。依據中國水仙NtSTK基因設計特異引物，分別為：NtSTK6：5′-GACTCACGCGGCTACTA

CCATGTC-3′，NtSTK7：5′- ACACCAATGTCCTCG

CTCCC TC-3′;用中國水仙Actin基因作為內參基因。Actin基因上游引物：5′-TGCCCAGAAGTGCTA

TTCCAG-3′，下游引物：5′-GTTGACCCACCACTA

AGAACAATG-3′。采用兩步法熒光定量PCR。反應體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，引物各0.4 μL，稀釋的cDNA 2 μL，補ddH2O到20 μL。反應程序：94 ℃預變性10 s，94 ℃變性5 s，57 ℃退火20 s，50個循環。以各樣品為模板進行分析，3次重復。

1.3 ?數據處理

試驗數據采用2-△△Ct方法進行處理。

2 ?結果與分析

2.1 ?中國水仙NtSTK基因的克隆

以中國水仙“金盞銀臺”的cDNA為模板，經PCR擴增后獲得了679 bp的片段（圖1）。Blast分析結果顯示，該序列與已登錄NCBI的多種植物的SEEDSTICK-like基因同源性都較高，其中與球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum，DQ 017703）、麝香百合（Lilium longiflorum，AY 522502）、雜種百合（Lilium hybrid cultivar，AB 359184）、雜種蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrid cultivar，AB 232953）和垂枝樺（Betula pendula，AM 283033）的同源性分別高達80%、79%、78%、78%和76%，可推斷此片段為中國水仙STK基因的保守區片段。

根據所設計的3′RACE引物，經PCR擴增，得到一條約600 bp的單一條帶（圖1）。測序結果顯示與保守區有395 bp的重疊區域，出現的第一個終止密碼子是TGA，獲得了中國水仙NtSTK基因的3′端。

根據所設計的中國水仙NtSTK基因的ORF引物，分別對‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙進行PCR擴增，分別得到ORF片段大小都為705 bp，分別命名為NtSTKJ，NtSTKY和NtSTKP。

2.2 ?中國水仙NtSTK基因生物信息學分析

將中國水仙NtSTKJ基因所編碼的氨基酸序列進行blast分析，結果表明該序列與其它物種中已知的SEEDSTICK-like基因氨基酸序列具有很高的一致性，其中與天門冬（Asparagus virgatus，BAD 83772）、百子蓮（Agapanthus praecox，BAC 66963）、風信子（Hyacinthus orientalis，AAF 08830）、小果野蕉（Musa acuminata，AAY 53908）和石斛蘭（Dendrobium nobile，ABQ 08574）等的同源性分別為91%、89%、88%、83%和82%，說明這些單子葉植物的SEEDSTICK類基因比較保守，‘金盞銀臺、‘玉玲瓏和平潭水仙的SEEDSTICK基因相似度很高，僅有3個堿基的差異，這些差異可能是基因本身的差異，也可能是PCR擴增或者測序誤差而導致的差異。

NtSTK基因編碼的氨基酸序列與不同物種STK基因氨基酸序列的比對結果（圖2）顯示，此類基因在C端都有AG類基因具有的高度保守的AGI基序和AGII基序;同時也具有單子葉植物STK類基因特有的MD基序。這些保守基序的存在說明NtSTK基因屬于D類MDAS-box基因。

為了研究STK基因的進化關系，采用MEGA5.0軟件構建了系統進化樹（圖3）。所有單子葉植物歸為一類，雙子葉植物歸為另一類。NtSTK與百子蓮的ApMADS2、風信子的HoMADS1聚在一起，且與蘭科植物的STK聚在一起，說明這些單子葉植物的STK相似度較高，預示著其功能具有一定的相似性。

2.3 ?組織表達分析

實時熒光定量PCR分析結果（圖4）顯示，NtSTK基因在“金盞銀臺”和“玉玲瓏”的雌蕊和子房中表達，在葉片和根中有微量表達，在花的其它部位以及鱗莖中均不表達。由于水仙的花蕾中已包含了發育的雌蕊和子房，故NtSTK在花蕾中也有表達。

3 ?討論與結論

通過基因重復事件產生不同的AG進化枝基因，這些不同類型的基因在序列上仍然比較相似，其蛋白C末端依然具有AGI基序和AGII基序[20]。在本研究中水仙的NtSTK也具有相似的基序，并且可與其它植物STK基因聚在一起，說明本實驗分離的NtSTK基因屬于D類基因。

不同植物AG基因的表達模式有一定差異，但均主要在雌蕊和雄蕊中表達。過去認為C類基因控制雄蕊和心皮的發育，如擬南芥中的AG[1];而D類基因參與胚珠的發育，例如矮牽牛中的FBP7和FBP11[21-22]。然而，近年來人們發現這2類基因的表達模式很難完全區分開。如球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum Rchb）的C類基因DthyrAG1和D類基因DthyrAG2在成熟花中的表達模式基本一致，在子房的發育過程中也均有表達[23];從蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）中克隆得到的C功能基因PhalAG1和D功能基因PhalAG2，二者在唇瓣、蕊柱及子房中都能表達，且表達情況基本沒有差異[24]。

本試驗對獲得的NtSTK基因進行了組織特異性表達模式研究，結果表明該基因只在中國水仙的雌蕊和子房中表達，說明NtSTK基因應該是AG基因家族中的一員，對中國水仙雌蕊和子房的發育起著一定的作用。

本實驗中發現，NtSTK（D類）在重瓣水仙“玉玲瓏”雌蕊和子房中的表達量都比在單瓣水仙“金盞銀臺”雌蕊和子房中的表達量要高，其他學者的研究表明水仙NTMADS1（C類）在中國水仙副冠、雄蕊和子房中均有表達[16]，產生這種現象的原因可能是中國水仙C類基因和D類基因在調控雌性生殖器官發育的過程中存在著功能冗余。

前人研究一般認為D類基因在胚珠發育過程中起核心作用，最新的研究成果改變這一認識。Heijmans等[25]重新分析了矮牽牛C類和D類基因的功能，在fbp7 fbp11突變體中，胚珠的發育很大程度上是不受影響，這表明胚珠的發育不僅僅是D類基因決定。當fbp7 fbp11雙突變體與PMADS3-RNAi株系或fbp6突變體之一結合，獲得了胚珠缺失嚴重的株系。這些結果表明，所有的矮牽牛AG成員在指定胚珠身份上功能冗余，不單單由D類基因來決定胚珠的特征。本實驗結果也暗示水仙雌蕊和子房的發育可能受C類基因和D類基因的共同調控。

參考文獻

[1] Coen E S， Meyerowitz E M. The war of the whorls： genetic interactions controlling flower development[J]. Nature， 1991， 353（6 339）： 31-37.

[2] Theissen G. Development of floral organ identity： stories from the MADS house[J]. Curr Opin Plant Biol， 2001， 4（1）： 75-85.

[3] Ferrario S， Immink R G， Angenent G C. Conservation and diversity in flower land[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2004， 7（1）： 84-91

[4] 孫崇波， 向 ?林， 李小白， 等. 蕙蘭Flowering locus T基因的克隆及其對開花的影響[J]. 中國農業科學， 2013， 46（7）： 1 419-1 425.

[5] Chang Y Y， Kao N H， Li J Y， et al. Characterization of the possible roles for B class MADS-box genes in regulation of perianth formation in orchid[J]. Plant Physiol， 2010， 152（2）： 837-853.

[6] Pan Z J， Cheng C C， Tsai W C， et al. The duplicated B-class MADS-box genes display dualistic characters in orchid floral organ identity and growth[J]. Plant Cell Physiol， 2011， 52（9）： 1 515-1 531.

[7] Colombo M， Masiero S， Vanzulli S， et al. AGL23， a typeⅠMADS-box gene that controls female gametophyte and embryo development in Arabidopsis[J]. Plant J， 2008， 54（6）： 1 037-1 048.

[8] Ferrario S， Shchennikova A V， Franken J， et al. Control of floral meristem determinacy inpetunia by MADS-box transcription factors[J]. Plant Physiol， 2006， 140（3）： 890-898.

[9] Ku A T， Huang Y S， Wang Y S， et al. IbMADS1（Ipomoea batatas MADS-box 1 gene）is involved in tuberous root initiation in sweet potato（Ipomoea batatas）[J]. Ann Bot， 2008， 102（1）： 57-67.

[10] Benlloch R， Roque E， Ferrándiz C， et al. Analysis of B function in legumes： PISTILLATA proteins do not require the PI motif for floral organ development in Medicago truncatula[J]. Plant J， 2009， 60（1）： 102-111.

[11] Kramer E M， Jaramillo M A， Di Stilio V S. Patterns of gene duplication and functional evolution during the diversification of the AGAMOUS subfamily of MADS-box genes in angiosperms[J]. Genetics， 2004， 166（2）： 1 011-1 023.

[12] Zahn L M， Leebens-Mack J H， Arrington J M， et al. Conservation and divergence in the AGAMOUS subfamily of MADS-box genes： evidence of independent sub-and neofunctionalization events[J]. Evol Dev， 2006， 8（1）： 30-45.

[13] Honma T， Goto K. Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs[J]. Nature， 2001， 409（6 819）： 525-529.

[14] Theissen G， Saedler H. Plant biology. Floral quartets[J]. Nature， 2001， 409（6 819）： 469-471.

[15] Ferrario S， Immink R G， Shchennikova A， et al. The MADS- box gene FBP2 is required for SEPALLATA function in petunia[J]. Plant Cell， 2003， 15（4）： 914-925.

[16] 陳段芬. 中國水仙花型、 花色發育基因（NTMADS1， NTMADS3， NTPDS1， NTPZDS1）的克隆與轉化[D]. 北京： 中國林業科學研究院， 2008： 62-65.

[17] 鄧新杰， 熊莉君， 王 ?洋， 等. 過量表達中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）NTAG1基因促進擬南芥早花和衰老[J]. 分子植物育種， 2011， 9（2）： 238-244.

[18] 吳菁華， 楊 ?超， 吳少華. 中國水仙NtPI基因的克隆與表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2012， 33（6）： 1 084-1 088.

[19] 楊 ?超， 吳菁華， 吳少華. 中國水仙NTAP1基因的克隆與表達分析[J]. 西北植物學報， 2014， 34（1）： 66-71.

[20] Kramer E M， Jaramillo M A， Di Stilio V S. Patterns of gene duplication and functional evolution during the diversification of the AGAMOUS subfamily of MADS-box genes in angiosperms[J]. Genetics， 2004， 166（2）： 1 011-1 023.

[21] Angenent G C， Franken J， Busscher M， et al. A novel class of MADS-box genes is involved in ovule development in petunia[J]. Plant Cell， 1995， 7（10）： 1 569-1 582.

[22] Colombo L， Franken J， Van der Krol A R， et al. Downregulation of ovule～specific MADS-box genes from petunia results in maternally controlled defects in seed development[J]. Plant Cell， 1997， 9（5）： 703-715.

[23] Skipper M， Pedersen K B， Johansen L B， et al. Identification and quantification of expression levels of three FRUITFULL-like MADS-box genes from the orchid Dendrobium thyrsiflorum[J]. Plant Sci， 2005， 169（3）： 579-586.

[24] Song I J， Nakamura T， Fukuda T， et al. Spatiotemporal expression of duplicate AGAMOUS orthologues during floral development in Phalaenopsis[J]. Dev Genes Evol， 2006， 216（6）： 301-313.

[25] Heijmans K， Ament K， Rijpkema A S， et al. Redefining C and D in the petunia ABC[J]. Plant Cell， 2012， 24（6）： 2 305-2 317.