海南粗榧內生真菌對羅非魚無乳鏈球菌抑菌活性研究

陽輝蓉 劉四新 李武 吳延春 胡文婷 劉翊昊 胡曉蘋 李從發

摘 ?要 ?利用活菌菌餅法和濾紙片法研究篩選64株海南粗榧內生真菌對羅非魚源無乳鏈球菌的抑菌活性，并對活性菌株的代謝產物化學成分進行初步測試。菌餅試驗結果顯示，11株海南粗榧內生真菌對無乳鏈球菌具有明顯抑制作用，占總菌株數的17.2%，抑菌圈在Φ（8.7±0.3～16.2±0.2）mm間。濾紙片試驗結果顯示，12株具有明顯抑制作用，占總菌數的18.8%，抑菌圈在Φ（8.7±0.3～28.2±0.4）mm間。2種方法的最高活性菌株不一致，但最高活性菌株（B30、F52）和同時顯示較高活性的菌株（B14、B30、B32、F7、F52）被測出都含有甾體及三萜類化合物。根據結果推測，對無乳鏈球菌有顯著抑制作用的菌株可能含有甾體及三萜類物質。結果為深入研究內生真菌對羅非魚無乳鏈球菌的抑制奠定基礎，也為生物防治羅非魚病害提供有益借鑒。

關鍵詞 ?海南粗榧;內生真菌;羅非魚;無乳鏈球菌;抑菌活性;甾體及三萜類

中圖分類號 ?R284 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Antimicrobial Activity of Endophytic Fungi from

Cephalotaxus hainanensis Li to Streptococcus

agalactiae Isolated from Tilapia

YANG Huirong1， LIU Sixin1， LI Wu1， WU Yanchun1， HU Wenting2，

LIU Yihao1， HU Xiaoping1， LI Congfa1 *

1 College of Food， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Marine， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?Fungal cake and filter paper methods were used to determine the antimicrobial activity of 64 endophytic fungi from C. hainanensis Li to S. agalactiae isolated from tilapia， and the chemical composition of the active strains was also detected. The results showed that： by the fungal cake method， eleven of 64 strains had significant inhibiting effect on S. agalactiae， 17.2% of the total number of strains， and the inhibition zone diameter ranged from（8.7±0.3）mm to（16.2±0.2）mm. By the filter paper method， there were 12 strains showing significant inhibiting effect on S. agalactiae， which accounting for 18.8% of the total number of the strains. The inhibition zone diameter ranged from（8.7±0.3）mm to（28.2±0.4）mm. The highest activity strain tested by the fungal cake method was not the same with that of the filter paper method. ?However， the strains of the highest activity（B30 and F52）and the strains of higher activity（B14， B30， B32， F7）， which obtained by fungal cake and filter paper methods， were inclusive of steroids and triterpenoids. This paper laid the foundation for further research on the endophytic fungal inhibity activity on S. agalactiae， and also provided a useful reference to the biological control of tilapia disease.

Key words ?Cephalotaxus hainanensis Li; Endophytic fungi; Tilapia; Streptococcus agalactiae; Antimicrobial activity; Steroids and triterpenoids

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.022

中國羅非魚（Tilapia）的生產和出口均為世界第一，是中國最具國際競爭力的淡水養殖品種，也是中國南方水產養殖的支柱性產業[1]。然而，由無乳鏈球菌（Streptococcus agalactia）、海豚鏈球菌（S. iniae）等引起的羅非魚病害，已成為目前羅非魚養殖業發展的重大阻礙，每年給全世界包括中國造成巨大的經濟損失[2]。無乳鏈球菌也被稱作B群鏈球菌[3]，還是引起奶牛乳房炎的病因之一，同時也是免疫抑制人群、孕婦、新生兒等的重要病原菌[4]。可見，鏈球菌病不僅對漁業和畜牧業產生巨大危害，而且對食品安全和人類健康也構成嚴重威脅[5]。

當前，在羅非魚養殖中通常使用抗生素、化學藥物等對鏈球菌病進行防治，但是存在較嚴重的停藥反彈現象，且存在病原菌耐藥性增強和魚體藥物殘留等明顯缺陷[6]，對人類健康產生安全隱患，同時也對生態環境造成不良影響。目前尚未找到對羅非魚鏈球菌病高效且安全的防治措施[7]，因此，對羅非魚鏈球菌病及對這些病原菌的相關研究尤為重要。近年來，研究者們熱衷于以中草藥對無乳鏈球菌、海豚鏈球菌的抗菌研究。吳穎瑞等[1]研究了153種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性。李一珊等[8]研究了黃連和五倍子的乙醇提取物對羅非魚源性鏈球菌生長曲線的影響。也有利用水產益生菌等開展的抑菌研究。植物內生真菌在活性物質種類和產量方面表現出巨大潛力，其合成的次生代謝產物不但化學成分豐富，而且具有多種多樣的生物活性，如抗腫瘤活性、抗病原微生物活性、抗病毒活性、酶抑制活性、免疫抑制活性和殺蟲活性等[9]，其中一些內生真菌由于能產生與宿主相同或相似的次生代謝產物[10]而研究熱度與日俱增，從中發現新化合物的報道也屢見不鮮[11]。海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li）及其內生真菌是本實驗室長期開展研究的方向之一，海南粗榧的多種組織中都能產生多種生物堿，其中三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿已被開發成抗白血病藥物[12]。本實驗室前期研究結果表明，分離自海南粗榧樹皮的內生真菌也能產生種類豐富的生物活性物質[13]。中國南方地區的羅非魚病多由無乳鏈球菌所致[14]，而目前尚未見關于內生真菌代謝產物對羅非魚病抑菌作用的相關研究報道。因此，本試驗以篩自海南省熱帶植物園、海南尖峰嶺和霸王嶺自然保護區的64株海南粗榧內生真菌為研究對象，研究其對羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑制活性，為尋找內生真菌來源的無乳鏈球菌抑制劑的深入研究奠定前期基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?海南粗榧內生真菌 ? 64株內生真菌篩選自海南省熱帶植物園、海南尖峰嶺自然保護區、霸王嶺自然保護區三地的海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li）樹皮、樹葉等組織，均保藏于本實驗室。

1.1.2 ?供試菌株 ? 羅非魚源無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae HYXY08），分離自羅非魚病魚，保存于本實驗室。

1.1.3 ?培養基 ? PDA培養基、PDB培養基、腦心浸液培養液（BHIB）、腦心浸液瓊脂培養基（BHIA）參照文獻配制[13]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌餅法抑菌活性測試 ? 將保藏的內生真菌在新鮮的PDA斜面上活化培養3～5 d，然后接種于PDA平板上，于28 ℃培養11 d后用于菌餅法活性測試。

將保藏的無乳鏈球菌HYXY08在新鮮的BHIA斜面上培養24 h，用BHIB洗下菌苔，充分渦旋搖勻，采用顯微計數法，將其稀釋為106 cfu/mL的菌懸液。取1 mL菌懸液混菌法制備無乳鏈球菌的檢測平板。

用Φ6 mm的滅菌打孔器制備每種內生真菌的菌餅若干片，無菌接種于無乳鏈球菌的檢測平板上，每株內生真菌設3個重復，以未接種的PDA瓊脂餅片作陰性對照（CK-1）置于平板中央。28 ℃培養24 h后測定抑菌圈直徑，取平均值[15]。

1.2.2 ?濾紙片法抑菌活性測試 ? 將每株內生真菌的斜面活化種子接種至300 mL PDB培養基中（1 L錐形瓶），每菌株3瓶平行，并設未接種的空白培養基作陰性對照（CK-2）。28 ℃，160 r/min振蕩培養11 d ，濾紙抽濾得到發酵上清液，以發酵液：乙酸乙酯=1 ∶ 1（V/V）超聲萃取，循環3次，減壓旋蒸、濃縮后得到代謝產物粗提物，4 ℃冷藏備用。

以丙酮溶解上述代謝產物粗提物、配成10 mg/mL的丙酮溶液，將其加到Φ6 mm的滅菌濾紙片上，每片加20 uL，風干后擺放于無乳鏈球菌的檢測平板上，每樣品設3個重復。以純丙酮溶劑吸附的濾紙片做陰性對照置于平板中央。28 ℃培養24 h后測定抑菌圈直徑，取平均值[16]。

1.2.3 ?活性菌株代謝物初步測試 ? 根據待測樣品與所加指示試劑發生的沉淀或顏色反應特征，初步推測其化學成分的種類。在試管中通過沉淀和顏色反應測試生物堿、甾體及三萜類化合物、蒽醌及其苷類、黃酮及其苷類和皂甙類化合物;在濾紙片上進行顏色反應測試酚類和有機酸化合物[17]。

1.3 ?數據處理

采用Microsoft Excel 對所得數據進行統計分析，結果以平均值±標準差（±SD）表示。

2 ?結果與分析

2.1 ?菌餅法抑菌活性測試

以菌餅法測試64株海南粗榧內生真菌對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌活性（表1），結果表明，有明顯抑制作用的有11株，占總菌株的17.2%。抑菌效果最好的是分離自海南省熱帶植物園的B30菌株，抑菌圈為Φ（16.2±0.2）mm;抑菌效果相對較好的有F45、A13、B14、B6等菌株，樣品來自海南省熱帶植物園（代號A和B）、海南尖峰嶺自然保護區（代號C、D、E）和霸王嶺自然保護區（代號F）。

2.2 ?濾紙片法抑菌活性測試

濾紙片法的測定結果（表2）表明，64株內生真菌代謝產物乙酸乙酯粗提物中有12株對羅非魚無乳鏈球菌具有明顯抑制作用，占總數的18.8%。抑菌效果最好的是分離自霸王嶺自然保護區的F52菌株，抑菌圈為Φ（28.2±0.4）mm，相對較好的有B32、A21、B14、B30、D4、F7、F103、F39等菌株。其中2種方法都顯示抑菌較好的是B14、B30、B32、F7和F52等菌株。

2.3 ?活性菌株代謝產物的初步測試

對12株活性菌的代謝產物逐一進行化學成分的初步測試，根據反應現象（沉淀、顏色等）預測其所含化合物的種類，結果（表3）表明，含有甾體及三萜類和生物堿類代謝產物的菌株較為豐富，分別有8株和6株;含有皂苷類的菌株有5株;含酚類和蒽醌及其苷類的均為4株;含黃酮及其苷類和有機酸較少，分別只有3株和2株。其中D4只顯示含皂苷類化合物，F39只顯示含生物堿，而A21顯示含有4類化合物，F127顯示含有6類化合物，這說明海南粗榧內生真菌的次級代謝產物種類多樣。其中菌餅法高活性菌株B30含有甾體及三萜類、酚類和生物堿類化合物;濾紙片法高活性菌株F52含有甾體及三萜類、蒽醌及其苷類和皂苷類物質，顯示2菌共有的成分是甾體及三萜類化合物，而2種方法均顯示較高活性的菌株B14、B30、B32和F7、F52中，都測試到含有甾體及三萜類。

3 ?討論與結論

當今，內生真菌產生的生物活性物質是一個研究的熱點。人們從內生真菌中分離到很多活性物質，如Zheng等[18]從人參的內生真菌分離出2個新化合物和6個已知化合物，其中化合物brefeldin A對MKN45、LoVo、A549、MDA-MB-435、HepG2和HL-60等6株癌細胞表現出極強的細胞毒性，其IC50<0.12 μg/mL，化合物ginsenocin和penicillic acid對這6株癌細胞也表現出很強的細胞毒活性，其IC50在0.49～7.46 μg/mL之間。Ferdinand等[19]從可可樹的一株內生真菌分離出3種新的聚酮類化合物，它們對腐霉、絲囊霉和紋枯病有極強的抑制作用。Hidayat等[20]從內生真菌中分離出3個已知化合物和3個新化合物，其中colletonoic acid表現出很好的抑制細菌、真菌和藻類的活性。本實驗室長期開展的海南粗榧內生真菌研究顯示其抑菌、抗癌活性高，次級代謝產物種類豐富，而對病原菌的抑菌作用機制尚不夠清楚，通常起作用的產物成分之間可能存在協同機制。本研究結果顯示：菌餅法和濾紙片法分別有11株和12株對無乳鏈球菌具有明顯抑制作用;這些內生真菌對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌代謝產物種類比較豐富多樣，但對無乳鏈球菌有顯著拮抗作用的菌株都含有甾體及三萜類化合物。而本研究所用菌餅法和濾紙片法所測得的最高活性菌株以及抑菌的作用不一致。這種現象可能的原因有：（1）2種方法培菌方法不同，內生菌所能合成的次級代謝產物種類和濃度可能不同;（2）2種方法所能測試的抑菌物質濃度不同，紙片法是乙酸乙酯提取、濃縮后所測，其抑菌圈顯然也大，因此推測菌餅法中的高活性菌株（如B30、F45、B14等）可能具有較強的抑菌物質合成能力，且能分泌到胞外。

本研究結果將為深入研究內生真菌對羅非魚無乳鏈球菌的拮抗作用奠定了基礎，也為生物防治羅非魚無乳鏈球菌病提供有益借鑒。

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