嗜硫小紅卵菌對常用除草劑“草克星”的解毒作用

研究的動機

吡嘧磺隆是農藥“草克星”的化學名稱。查詢資料后我們發現，吡嘧磺隆是人工合成的化合物，在自然環境中較難分解，對多種敏感作物產生毒害作用。用什么方法能夠解決吡嘧磺隆的毒害問題呢？我們想到微生物是自然界中生長、進化速度最快的類群，在吡嘧磺隆高濃度環境下（如農藥廠排污口處），是否會有個別微生物進化出解毒能力呢？如果能夠篩選到這種解毒微生物，將會對解決吡嘧磺隆的殘留藥害有極大幫助，但這是否有實際可操作性呢？

研究方法與過程

耐吡嘧磺隆脅迫微生物富集培養

采用富集培養法配制富集培養基，采用搖瓶富集培養：取1O.Og采集的土樣，加入50mL富集培養液中，培養液吡嘧磺隆初始濃度設定為50mg/L，置于28℃、180r/min恒溫搖床上培養7天之后，以2%的接種量接入新鮮培養液中，每隔l周轉接1次，并以10mg/L為梯度逐漸提高吡嘧磺隆濃度至100mg/L，連續培養6輪，空白對照組同樣連續培養6輪。

吡嘧磺隆解毒微生物檢驗

本實驗參照鐘亞蘭等運用高效液相色譜表征高聚物的方法（鐘亞蘭等，2010）對吡嘧磺隆的量的變化進行測定，檢驗耐高濃度吡嘧磺隆脅迫微生物中可對其產生解毒微的生物是否存在。在富集培養最后一次轉接前及經歷7天培養后，各取培養物1.5mL，用高速離心機以12000r/min離心5min，上清液經0.22μm水相濾膜過濾，取濾液檢測。

最后以吡嘧磺隆的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪出標準曲線，求出峰面積和濃度的相關方程。

解毒菌的分離與純化

參照已有方法，采用10倍稀釋法將富集液稀釋，再用平板傾注法分離單菌，分別得到10-8～l0-1濃度的富集液；對每一梯度濃度稀釋液各取100μL加入到2個滅菌的培養皿中，其中一個培養皿倒入0.5cm厚的牛肉膏蛋白胨培養基，另一培養皿倒入0.5cm厚的PSA培養基，在超凈臺的臺面上水平混勻稀釋液和培養基，冷卻凝固后，置于28℃恒溫培養箱中倒置培養，牛肉膏蛋白胨平板培養3天觀察菌落，PSA平板培養5天觀察菌落。將單菌落挑出，在相應平板上用四線法劃線純化菌株。

單菌解毒實驗

在吡嘧磺隆濃度50mg/L的富集培養基中，分別接種純化后的菌落，28℃、180r/min恒溫搖床培養7天，同時以不接菌的培養基為空白對照；分別取培養前及培養7天的培養物1.5mL，12000r/min離心5min，取上清液過0.22μm的水相濾膜，取濾液檢測。

吡嘧磺隆解毒菌的鑒定

Yc-5菌株的形態觀察：以雙層平板夾心層上生長的菌落形態描述菌落顏色、大小和形狀。菌體的其他形態特征、培養特性及生理生化實驗參照文獻相應進行。

Yc-5菌株的rDNA-ITS分子鑒定：首先進行DNA擴增，將擴增的產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠回收，回收純化后的產物送華大基因公司測序。將測得的ITS序列在GenBank中利用BLAST進行比對，選取一些與該序列最相似的其他菌株的序列，然后用軟件MEGA4.0進行序列分析，再構建系統發育樹，查看Yc-5與其他菌株親緣關系的大小。

解毒菌解毒特性及實際應用研究

采用比濁法反映菌株生長并動態跟蹤檢測吡嘧磺隆濃度變化，繪制解毒菌生長解毒曲線。

若想要Yc-5解毒菌最大程度地發揮其吡嘧磺隆解毒能力，就要使其處于較優的解毒條件下，為此我們又對Yc-5解毒吡嘧磺隆的最佳條件進行了初步探索，還用油菜苗和飼養中的小蝦做了解毒菌實際應用實驗。

結果與討論

耐吡嘧磺隆脅迫微生物富集培養

我們在湖南海特農藥廠吡嘧磺隆生產車間采集了幾袋污泥作為后續富集培養的樣品來源（圖1）。富集培養后，與未轉接移種的空白對照組相比較，污泥實驗組培養瓶中培養液明顯渾濁致密，同時瓶體有少量細胞沉積（圖l左）。這表明富集培養液中有大量微生物在生長、繁殖。

吡嘧磺隆解毒微生物檢驗

農藥等有機物的濃度變化可通過色譜或質譜技術測定、顯現。我們運用高效液相色譜測定吡嘧磺隆的量的變化，進一步證實富集培養基中是否存在能夠分解吡嘧磺隆的微生物。結果表明不接菌的空白對照組濃度幾乎未發生任何變化，而接種并經7天富集培養后的實驗組，吡嘧磺隆濃度均顯著下降。結果證實富集培養基中存在可解毒吡嘧磺隆的微生物群落。

解毒菌的分離與純化

雖然富集培養瓶中證實有吡嘧磺隆解毒微生物的存在，但其中的微生物菌落混雜、成分不明，究竟是哪一種或哪幾種微生物起到主要的解毒作用必須加以明確。參照已有方法，采用10倍稀釋法將富集液稀釋，再用平板傾注法分離單菌。本項目最終將其歸類為7種不同的菌，并分別命名為Yc-1、Yc-2、Yc-3、Yc-4、Yc-5、Yc-6、Yc-7（圖2）。通過初步形態觀察，其中l株為真菌（Yc-3），其他6株均為細菌。

單菌解毒實驗

為了進一步確定分離純化得到的不同菌落中，究竟是哪一種或幾種微生物對吡嘧磺隆有分解解毒作用，我們設置了單菌解毒實驗進行驗證。結果顯示，不接菌的空白對照組濃度幾乎未發生任何變化，在分離純化得到的菌株中有l株菌Yc-5具高效解毒效果，7天培養后對吡嘧磺隆的解毒率達51.6%。

吡嘧磺隆解毒菌的鑒定

再次查閱文獻后，我們決定從菌株形態及分子遺傳兩方面對解毒菌Yc-5進行鑒定。結果表明，該解毒菌與Rhodovulum sulfidophilum strainsy59親緣關系最為接近。綜合形態學鑒定和分子鑒定，Yc-5屬于嗜硫小紅卵菌（Rhodovulum sumdopruius）。

解毒菌實際應用初探

為證實解毒菌Yc-5在實際生產中的利用價值，我們初步探索了解毒菌對遭受吡嘧磺隆藥害的油菜幼苗的生長恢復效應，及降低幼蝦受毒害致死的緩解作用。

油菜苗生長恢復實驗：與栽培無菌土中噴灑了含Yc-5菌株菌液的處理組對比，對照組中的油菜幼苗生長發育遲緩、植株低矮，莖稈纖細、易折斷，葉片較小、疏松稀落，花蕾數量少且成功開花率較低；而由Yc-5菌株菌液進行解毒作用的處理組油菜幼苗生長狀態顯著改善，植株高大直挺，花葉較為茂盛。

幼蝦生長飼養實驗：全程觀察幼蝦整體生長狀態，與空白對照組相比，添加了Yc-5菌株菌液的處理組中幼蝦較為活躍、游動頻繁，說明該菌株對水體中吡嘧磺隆也具有良好的解毒作用。

結論與展望

本項目從現實生活中的實際問題出發，采用富集培養方法，從長期經受吡嘧磺隆污染的污泥中分離篩選得到了l株吡嘧磺隆解毒菌Yc-5；該菌株可通過共代謝高效解毒吡嘧磺隆；通過形態特征及ITS序列分析將其鑒定為嗜硫小紅卵菌（Rhodovulumsulfidophilus）；采用室內培養方法，研究了Yc-5對吡嘧磺隆的解毒特性，菌株生長2-5天為吡嘧磺隆解毒高峰階段；均勻實驗結果表明，在基礎培養液中，在接種量為6%、溫度為31℃、吡嘧磺隆濃度為50mg/L條件下，可獲得最優解毒效果，培養7天解毒率達84.7%。油菜苗生長恢復實驗和幼蝦生長對比實驗表明解毒菌Yc-5具有較高的實際應用價值，該菌為吡嘧磺隆等類似有機物污染的高效治理提供了有效的解決途徑。

該項目獲得第29屆全國青少年科技創新大賽創新成果競賽項目中學組環境科學一等獎。

專家評語

該項目針對南方地區使用大量的除草劑“草克星”引發的可能環境問題，從有效降解草克星、降低其毒害作用等入手，開展了具有降解作用微生物的篩選鑒定。項目整體設計科學，具有創新性，研究結果整體性強并獲得了有效數據。