現代生物技術的應用與管理

【摘 要】在科學技術迅速發展的21世紀，生物技術作為一種可能改變未來經濟格局的技術，在醫藥健康、環境保護、新能源、新材料，現代農業和海洋等領域發揮著越來越重要的作用，然而盲目地開發與濫用同樣會給人類健康和生態環境帶來潛在的威脅，對其進行合理的利用和管理就顯得尤為關鍵。以三種具有代表性的生物技術為例，結合其具體的應用價值分別論述了它們的發展與前景，研究探討了促進社會經濟效益的管理方法，并根據當前趨勢提出建議以供相關領域的同行和專家參考借鑒。

【關鍵詞】生物技術；基因測序；生物芯片；雙向電泳；管理

The Application and Management of Modern Biotechnology

ZHANG Dong-wei

（Shanghai Jiemin Biotechnology Co.，Ltd China Shanghai 200000）

【Abstract】During the rapid development of science and technology in the 21st century，biotechnology plays a very important role in healthcare， environment，new energy material，agriculture ocean etc.As a new possible solution that may transform the economic layout in the future，it could also cause serious consequences to human health and ecologic balance by over deployment or abuse， therefore proper utilization and management would become crucial.This article would describe the application and prospect about modern biotechnology by three classic examples respectively， and then discuss several management approaches that could add more value to human society.Meanwhile it makes some suggestions for peers and experts’reference in related field based on current trends.

【Key words】Biotechnology；Gene sequencing；Biochip；Two-dimensional electrophoresis；Management

0.引言

生物技術（Biotechnology）是應用生命科學研究成果，以人們的意志設計，對生物或生物的成分進行改造和利用的綜合性新興技術，涵蓋了基因工程、分子生物學、遺傳學、胚胎學、物理學、化學、信息學和計算機科學等多門學科，具有廣泛的應用前景。近半個世紀來，生命科學在分子水平上取得了突破性成就，生物技術也得到了長足的發展，生物學家的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息轉移到在整體水平上對生物功能的研究。生命科學是實驗科學，快速準確地獲得生物體的遺傳信息對于生命科學研究具有十分重要的意義，因此生命科學的發展極大地依賴于生物技術的發展。以DNA序列分析技術為核心的基因組研究技術推動了基因組研究的日新月異；而以生物芯片技術為代表的基因表達研究技術為科學家了解基因表達規律立下汗馬功勞；在蛋白質組研究中，二維電泳和質譜技術的黃金組合又為科學家掌握蛋白質的表達規律再鑄輝煌。在后工業化時代背景下，生物技術發展面臨的主要課題仍然是人口、環境和資源。

1.基因測序技術

基因是攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，是控制性狀的基本遺傳單位。基因通過指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制著生物個體的性狀表現，支持著生命的基本構造和性能。由30億個堿基對組成的人類基因組大約含有2.5～4萬個基因，儲存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡過程的全部信息。基因測序是國際上公認的一種基因檢測標準，是基因工程和分子生物學領域最重要的技術之一。它能夠從血液、唾液等組織樣本中分析測定基因全序列，預測罹患多種疾病的風險，從而通過改善自己的生活環境和生活習慣，避免或延緩疾病的發生。目前仍然主要應用于科研領域，在相關準入標準、管理規范出臺以前，還不能夠應用于臨床實踐。

基因測序技術是遺傳學研究發展起來的，能夠真實反映DNA的遺傳信息，是了解基因結構和功能的基礎，可以應用于腫瘤學、免疫學、微生物學等多門學科。1977年Maxam和Gilbert報道了化學降解法，同年Sanger推出了雙脫氧鏈終止法，Sanger法簡便快捷并且適合于自動化測序，因而得到了廣泛的應用。上世紀80～90年代，學術界開始涉足人類基因組計劃，有力地推動了全自動測序技術的發展。基因測序儀得到了重大改進，毛細管電泳取代了傳統的薄層板凝膠電泳，采用專利的熒光標記和CCD成像技術，實現了自動灌膠、進樣、數據收集與分析等功能，是一臺可以測定DNA的堿基順序或定量DNA片段大小的精密儀器。在計算機控制下有96或384通道兩種可選模式，能夠在24小時無人干預狀態下工作，測序的平均成功率可達85%，讀長接近1000bp。配合不同的試劑盒還可以進行微衛星序列分析、單核苷酸多態性分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。

圖1 基因測序

進入21世紀后，采用微磁珠和高密度芯片的第二代測序技術應運而生，其核心思想是使DNA模板與固體表面相結合，然后邊合成邊測序，通過捕捉新合成的末端標記來確定DNA序列，克服了傳統測序方法成本高、效率低等缺點。二代測序技術是測序技術發展過程中一次革命性的改變，是一次可以對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定的大規模平行測序技術，同時使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，因此具有更好的尋找和發現新信息的能力，又被稱為深度測序[1]。例如利用合成法測序的454技術和利用連接法測序的SOLiD技術，這些測序平臺的共同特點是不需要大腸桿菌系統進行DNA模板擴增，由于測序讀長較短帶來了后續大量的數據拼接和注釋工作，其中454測序技術的讀長已經提高到400bp，SOLiD系統原始堿基數據的準確度大于99.94%。二代高通量測序可以幫助研究者跨過文庫構建這一實驗步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差，比較適合于對已知序列的基因組進行重新測序，而在對全新的基因組進行測序時還需要結合第一代測序技術。

運用第一代Sanger測序技術完成人類基因組計劃耗資近30億美元，歷時大約13年；而第二代SOLiD技術完成基因組測序只需幾周的時間，成本降到100萬美元以下，單次運行能產生50GB的數據，相當于基因組的17倍覆蓋度。新一代測序技術提高了速度，但測序產生的海量數據卻為后續的分析與儲存帶來巨大的挑戰，現有的生物信息分析軟件還沒有能力處理如此大量的數據資料，只有發展出能迅速準確分析和儲存大量測序數據的軟件和方法，才能充分體現出新技術高通量和高準確度的應用價值。另外新一代測序儀的價格大約在50～100萬美元，一般實驗室是難以負擔的，因此對于Kb到Mb范圍的小型項目，傳統的DNA測序方法無疑還是最佳選擇。但在全基因組測序、鑒定體細胞突變及病毒細菌感染與變異等大型基因組計劃的實施中，新一代測序技術將發揮巨大作用。

第三代測序技術最大的特點是單分子實時測序，測序時無需PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序，其分辨率具有不可比擬的優勢，因此在稀有突變及其頻率的測定中可以大顯身手。單分子熒光測序是通過顯微鏡對DNA鏈合成時的熒光強度變化進行實時記錄來完成的，在蝕刻有納米結構的微陣列芯片上放置數以千計的波導管，每個波導管的空間僅能容納一個DNA分子外加一個DNA多聚酶分子，在一塊小小的芯片上能同時進行數千個測序反應；納米孔測序是借助電泳技術驅動單個分子逐一通過納米孔來實現的，在外切酶的輔助下，納米孔的直徑僅允許單個核酸聚合物通過，而不同堿基的帶電性質不一樣，通過電信號的差異就能檢測出通過的堿基類別。三代測序技術保留了DNA聚合酶自身內在的反應速度和延續性，同時系統誤差和干擾會顯著減小，精確度能達到99.9999%[2]。利用這種技術組合，科研人員能夠在24小時內獲取基因組信息，檢測費用也降到了最低1千美元。據預測，DNA測序技術可能跟隨計算機技術和通訊技術成為第三個“摩爾定律化”的學科產業，并將推動個性化醫療的全面發展。

昂貴的費用曾經是阻礙個體基因組測序普及的最大障礙，而隨著新的高通量測序技術的發展，測序成本的不斷降低，以及在計算機技術的輔助下拼接大量的基因組序列信息，可以更加方便快捷地獲取個體遺傳信息，DNA測序技術已由一項前沿技術迅速普及為生命科學領域的常規技術。每一種測序方法都具有一定的優勢和局限，針對特定目的的基因分析，進行合理的評估，根據具體需求選擇或搭配合適的測序平臺才是最佳的解決方案，雖然第二、第三代測序技術有很大的通量，基于Sanger原理的毛細管電泳測序仍然是高精度測序的黃金標準，是一種既能從頭測序又能從頭組裝的成熟技術，可以協助驗證新一代測序技術的準確性和精確度。人類基因組計劃破譯了人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認識自我，盡管發表于2001年的基因組仍然處于有待完善的階段中，但其已作為基因組的參照序列而被采用，成為生命科學轉化為實際應用的基礎，并繼續對研究基因型和表現型的關系，揭示生物進化和生命起源的奧秘發揮著重要的作用。

2.生物芯片技術

在20世紀末，生物技術和電子技術相結合誕生了半導體芯片的兄弟—生物芯片（biochip），這將給人類的生活和健康帶來深遠的影響，對社會的可持續性發展也會起到不可估量的作用。目前主要分為兩大類：用于生物計算機等生物電子產品制造的生物電子芯片和用于各種生物大分子、細胞、組織操作以及生物化學反應檢測的生物分析芯片，前一類目前在技術和應用上還不成熟，一般情況下生物芯片所指的是生物分析芯片。生物芯片在生命科學研究及實踐、醫學科研及臨床、藥物設計、環境保護等各個領域有著廣泛的用武之地，既具有重大的基礎研究價值，又具有明顯的產業化前景。

生物芯片技術的起源最初得益于埃德溫·邁勒·薩瑟恩（Edwin Mellor Southern）提出的核酸雜交理論，即標記的核酸分子能夠與被固化的與之互補配對的核酸分子雜交，從這一角度而言，Southern雜交可以被看作是生物芯片的雛形。生物芯片的基礎研究始于20世紀80年代末，本質上是一種生物技術，主要是在生物遺傳學領域發展起來的，是融微電子學、生物學、物理學、化學和計算機科學為一體的高度交叉的新技術。它是通過縮微技術，根據分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學領域中不連續的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統，以實現對細胞、蛋白質、基因及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片和組織芯片；根據原理的不同，還可以分為元件型、通道型微陣列芯片以及生物傳感芯片。由于常用硅片作為固相基質，且在制備過程中模擬計算機芯片的制備技術，所以稱之為生物芯片技術。

微陣列芯片（microarray）是指高密度固定在支持介質上包含生物信息的分子點陣，每個分子的序列及位置都是已知的，并且是預先設定好的。該技術采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而獲取樣品中靶分子的數量或序列信息。例如基因芯片，它是DNA雜交探針技術與半導體工業技術相結合的結晶，具有高通量、微量化和自動化等特點。基因芯片技術由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交技術操作繁雜、序列數量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。表達譜基因芯片是用于基因功能研究的一種基因芯片，是目前技術比較成熟，應用最廣泛的一種基因芯片，其主要的優點是：檢測系統的微型化，對樣品需要量非常小，檢測基因表達變化的靈敏度高，可檢測豐度相差幾個數量級的表達情況，而且節約費用和時間。采用表達譜基因芯片研究基因表達可以同時研究上萬個基因的表達變化，研究效率明顯提高，能更多地揭示基因之間表達變化的相互關系，從而研究基因與基因之間內在的作用關系，使研究更具目的性和系統性，同時也拓寬研究領域。微陣列芯片技術是系統生物技術的基本內容，能為現代醫學發展提供強有力的手段，促進醫學從“系統、血管、組織和細胞層次”向“DNA、RNA、蛋白質及其相互作用層次”過渡。

圖2 基因芯片

微型芯片實驗室（lab-on-a-chip）是生物芯片技術發展的高級階段，或稱微全分析系統（Micro Total Analysis System），是指把生物或化學領域所涉及的樣品制備、生物與化學反應、分離檢測等基本操作單位集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學反應過程，并對其產物進行分析的一種技術。它是通過分析化學、微機電加工、計算機、電子學、材料科學與生物學、醫學和工程學等技術，實現從試樣處理到檢測的微型化、自動化與集成化這一目標。功能化芯片實驗室大體包括三個部分：一是芯片，將微泵、微閥、管道、流量控制與反應器等高度集成化，完成液體在芯片內部的定向流動與分配等功能；二是分析儀，包括驅動源和信號檢測裝置；三是實現芯片功能化的方法與試劑盒[3]。最近的發展表明，90年代初由Manz等人提出的以微電子加工技術為依托的芯片實驗室的發展將會像四十年前微電子技術在信息科學的發展中引發一場革命一樣，預計芯片實驗室將在未來的發展中對分析科學乃至整個科學技術以及相關的產業界產生相似的作用。計算機芯片使計算微型化，而芯片實驗室使實驗室微型化，在生物醫學領域它可以使珍貴的生物樣品和試劑消耗降低到微升甚至納升級，而且分析速度成倍提高，成本成倍下降；在化學領域，以前需要在一個大實驗室花費大量樣品、試劑和很多時間才能完成的分析和合成，將在一塊小的芯片上花很少量樣品和試劑以很短的時間同時完成；在分析化學領域，它可以使以前大的分析儀器變成平方厘米尺寸規模的分析儀，將大大節約資源和能源。芯片實驗室排污很少，所以是一種“綠色”技術。

目前，生物芯片已從主要應用的生命科學領域擴展到其它領域，產業化發展越來越明顯、越快速。例如用于DNA、RNA、蛋白質等方向分析檢測，還用于化學和生物試劑、環境污染的監測；監控微秒級的化學和生物化學反應動力學；用于許多化學合成反應的研究，藥物和化學合成與篩選等。因此，芯片實驗室不僅為生物醫學家，也為合成化學家打開了通往無限美好明天的大門。由于它的基礎研究和技術研究越來越專和精，使整體技術發展速度加快，再加之它朝著檢測功能化方面發展，可能成為新的經濟增長點。因此生物芯片在經濟、社會及科研等方面的應用前景越來越廣，其產值有可能超過微電子芯片，成為下一個具有巨大商業潛力的高技術產業。

3.蛋白質雙向電泳技術

蛋白質（protein）是生命的物質基礎和生命活動的主要承擔者，是構成生物體的主要大分子。蛋白質占人體重量的16%～20%，人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例組合而成的，并在體內不斷進行代謝與更新。1994年由Marc Wilkins提出了蛋白質組學，指的是在大規模水平上研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識。蛋白質組的研究不僅能為生命活動規律提供物質基礎，也能為眾多種疾病機理的闡明及攻克提供理論根據和解決途徑，蛋白質組研究的發展是以雙向電泳技術作為核心的。

雙向電泳技術（two-dimensional electrophoresis）是分析從細胞、組織或其他生物樣本中提取的蛋白質混合物的有力手段，通過第一向等電聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳，將不同種類的蛋白質按照等電點和分子量的差異在二維平面上進行分離，并得到每種蛋白質的等電點、表觀分子量和含量等信息。等電聚焦電泳是60年代中期問世的一種利用等電點不同在pH梯度介質上分離蛋白質的電泳技術，其特點是分辨率高，不受擴散作用的影響。等電聚焦是一個與pH相關的平衡過程，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳，在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，當其遷移至等電點的位置時靜電荷數為零，這樣蛋白質在電場中以不同的速率靠近并最終停留在各自的pI值；聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺作為支持介質的一種常用電泳技術，網狀結構的凝膠具有分子篩效應，加入陰離子去污劑和強還原劑十二烷基硫酸鈉后，能消除不同蛋白分子間的電荷差異和結構差異，因而電泳遷移率就取決于分子量的大小，可以直接測定蛋白質的分子量，一般采用不連續緩沖系統來獲得較高的分辨率[4]。O’Farrell于1975年首次建立二維電泳并成功地分離出約1000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化的。隨著技術的飛速發展，現在最多已能分離出10000個斑點，當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行。

蛋白質組研究實質上是在細胞水平上對蛋白質進行大規模的平行分離和分析，因而要求有高分辨率的蛋白質分離技術及準確、靈敏的質譜鑒定技術，如何提高雙向電泳的分離容量、靈敏度和分辨率以及對蛋白質差異表達的準確檢測是目前雙向電泳技術發展的關鍵問題。雙向電泳技術雖然難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、分辨率和重復性好以及可與質譜聯用的特點，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質組研究手段。以雙向電泳和質譜分析為基礎的蛋白質組學研究的程序為：樣品制備→等電聚焦→聚丙烯酰胺凝膠電泳→凝膠染色成像→軟件分析定量→采集感興趣的蛋白質點→膠內酶切→質譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用數據庫確定蛋白。蛋白質組研究的主要困難是對用雙向凝膠電泳分離出來的蛋白質進行定性和定量的分析。

雙向電泳技術發展的趨勢是在第一維等電聚焦電泳中采用范圍窄的PH梯度凝膠，以及開發高靈敏度的的蛋白質熒光染色技術，凝膠電泳中蛋白質的著色不僅影響蛋白質分離的分辨率，同時也影響后續的質譜鑒定。樣品的制備和溶解同樣事關雙向電泳的成效，用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白以提高分辨率。樣品預處理涉及溶解、變性和還原，可以完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質。此外，固相化PH梯度技術建立了穩定的并可以精確設定的PH梯度，避免了載體兩性電解質向陰極漂移等許多缺點，增大了蛋白質的上樣量，提高了雙向電泳的分辨率和可重復性[5]。蛋白質研究技術遠比基因技術復雜和困難，蛋白質組學研究的成功與否，很大程度上取決于其技術方法水平的高低，可以說蛋白質組學的發展既是技術所推動的也是受技術限制的。

圖3 蛋白質雙向電泳

Unlu等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE）的定量蛋白質組學分析方法，比經典的雙向電泳具有更高的動力學范圍和靈敏性。差異凝膠電泳是雙向電泳在技術上的改良，結合多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，并第一次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質采用不同的熒光標記，混合后再進行雙向電泳，用來檢測蛋白質在兩種樣品中的表達情況，極大地提高了結果的準確性、可靠性和可重復性。由于每個蛋白點都有自己的內標，軟件可全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的，解決了系統誤差的問題。在DIGE技術中，不同樣品在同一凝膠上電泳后產生多個凝膠圖像，避免了幾種雙向電泳的比較，并且能夠在納克級進行檢測，通過Internet可以獲得參考圖譜。較早期的雙向電泳相比，有兩個主要的進步：首先，極高的重復性可以用來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達；其次，高加樣量使得雙向電泳成為一項真正的制備型技術。

成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質進行分離，近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法，蛋白質組學技術的發展已經成為現代生物技術快速發展的重要支撐，并將引領生物技術取得關鍵性的突破。由于雙向電泳技術在蛋白質組與醫學研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質轉錄及轉錄后修飾研究，蛋白質組的比較和蛋白質間的相互作用，細胞分化凋亡研究，致病機制及耐藥機制的研究，療效監測，新藥開發，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研制等許多方面。通過對正常個體及病理個體間的蛋白質組比較分析，可以找到某些疾病特異性的蛋白質分子，它們可成為新藥物設計的分子靶點，或者也會為疾病的早期診斷提供分子標志。確實，那些世界范圍內銷路最好的藥物本身是蛋白質或其作用靶點為某種蛋白質分子。因此，蛋白質組學研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業帶來巨大的利益。蛋白質組學的研究是生命科學進入后基因組時代的特征，蛋白質組學與其它大規模科學如基因組學，生物信息學等領域交叉融合，呈現出系統生物學（Systems Biology）研究模式，將成為未來生命科學的新前沿。

4.總結

我國具有豐富的生物資源，合理地開發和利用生物技術對國民經濟的健康協調和可持續性發展有著非常重要的意義。另一方面，有效的創新能力不足，資金投入有限，管理和技術人才缺乏是目前制約生物技術進一步發展的主要因素。在資源有限的情況下，避免從事低水平，重復性的研究工作，相對集中一部分人力，物力和財力，建立集生物技術，自動化技術和信息技術為一體的研發中心，可能是適合我國國情的發展道路。加強各大專院校、科研院所重點實驗室儀器設備的配置和管理，優化資源共享與人才交流的機制，創造良好的環境促進具有明顯效益和前景的科研成果轉化應用。條件成熟時，可以有針對性地根據具體需求，國內自主研發新一代的科研儀器。

生物技術研究中不斷涌現出新信息、新技術、新療法、新藥物和新觀念等等新事物，在一定時期內還難以判定其利弊優劣，在采用它們或研究它們時，必然涉及道德、法律和社會問題。例如：生物信息的隱私權問題，基因診斷、治療和預防中的安全性問題，個人遺傳信息的知情同意權問題，并由此引發出來的保險權、工作權、繼承權、生育權等等問題。面對當前生命科學工業的趨勢形成，生物技術的產業化應當有規化有節制地進行，生物科技在一定程度上造福了人類社會，同時也帶來了環境安全和社會倫理等一系列問題，基于生物技術發展有可能帶來的不利影響，如何采取有效預防和控制措施，對其進行科學管理，逐步提上了日程。

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