注射用頭孢曲松鈉無菌檢查方法驗證試驗

【摘 要】頭孢曲松鈉屬第三代頭孢菌素，具廣譜抗菌作用.本實驗對注射用頭孢曲松鈉無菌檢查方法進行驗證驗證。方法：采用薄膜過濾法以500ml/筒緩沖液沖洗量檢查，結果：頭孢曲松鈉對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除。

【關鍵詞】注射用頭孢曲松鈉；無菌檢查；驗證

頭孢曲松鈉屬第三代頭孢菌素，具廣譜抗菌作用，對流感嗜血桿菌、腸桿菌科細菌、淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌有較強抗菌作用，對陰溝腸桿菌、不動桿菌屬和銅綠假單胞菌作用較差[1-5]。頭孢曲松鈉化學名為[6R-[6a，7b（Z）]]-7[[2，3-二氫-2-亞氨基-4-噻唑基）（甲氧亞氨基）乙酰基]氨基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜二環[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸鈉鹽[6-8]。頭孢曲松鈉常用于肺炎、燒傷感染、腹膜炎、支氣管炎、尿道感染、敗血癥、腦膜炎、皮膚及傷口的感染、胃腸道感染、肺化膿癥、腎臟感染、生殖器感染等[9-10]。無菌檢查采用薄膜過濾法是取樣量較大的集菌方法，具有代表性，不易漏檢等特點[11-13]。本實驗對注射用頭孢曲松鈉無菌檢查方法進行驗證驗證。

1.試驗環境與材料

1.1試驗環境

在環境潔凈度為B+A的無菌室中進行。

1.2儀器

NKF330一次性全封閉集菌培養器（杭州泰林生物技術設備有限公司）、HTY-601智能集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）、HY-2（A）調速多用振蕩器（常州華冠儀器制造有限公司）、SPX-250智能生化培養箱（常州華冠儀器制造有限公司）、MJX-150B智能霉菌培養箱（常州華冠儀器制造有限公司）、YXQ-LS-30SII高壓滅菌鍋（西安常儀儀器設備有限公司）、FB224電子分析天平（江蘇淮安翔宇電子衡器公司）。

1.3試驗用菌株

生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）、白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]（第4代）、大腸埃希菌ECMCC（B）44lO23（第3代）、黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）。

1.4培養基、稀釋液及緩沖液

1.4.1干粉培養基

硫乙醇酸鹽培養基（湖北鑫潤德化工有限公司）、改良馬丁瓊脂培養基（威海新月化玻儀器有限公司）、改良馬丁培養基（上海研域生物科技有限公司）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（上海研域生物科技有限公司）、營養瓊脂培養基（威海新月化玻儀器有限公司）。

1.4.2細菌稀釋液

氯化鈉溶液（廣州百特醫療用品有限公司）。

1.4.3沖洗用緩沖液

pH 7.0氯化鈉一蛋白胨緩沖液（上海研域生物科技有限公司）。

2.方法與結果

2.1菌液制備

（1）取經30℃～35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的肉湯培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-7，備用。

（2）取經30℃～35℃培養18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養基的新鮮培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-7備用。

（3）取經23℃～28℃培養24～48h的白色念珠菌液體培養物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-6，備用。

（4）取經23℃～28℃培養5～7天的黑曲霉斜面培養物，加3～5ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4，備用。

2.2菌液計數

每種菌液接種2個平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml，注入約15毫升、45攝氏度改良馬丁瓊脂平皿，經26攝氏度生化培養箱培養72小時，金黃色葡萄球菌液、枯草芽孢桿菌液、生孢梭菌液、大腸埃希菌液各1ml，注入約15 毫升、45攝氏度營養瓊脂平皿，經36攝氏度生化培養箱培養48小時，活菌計數。生孢梭菌[CMCC（B）64 941]（第4代）菌落數78cfu/ml，白色念珠菌[CMCC（B）98 001]（第4代）菌落數65cfu/ml，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]（第4代）菌落數75cfu/ml，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]（第4代）菌落數，69cfu/ml，大腸埃希菌ECMCC （B）44lO23（第3代）菌落數82cfu/ml，黑曲霉[CMCC（B）98 003]（第3代）菌落數62cfu/ml。

2.3方法的驗證采用薄膜過濾法

2.3.1供試液制備

取供試品15支溶于500ml0.9%的無菌氯化鈉溶液中，分別置于七個濾筒中過濾，沖洗液用量為每筒500ml，每次50ml，在最后一次沖洗中分別加入1ml已制備好的上述7株菌液（約為10～100個/筒），依照2010年版《中國藥典》二部附錄無菌檢查法，加入相應的培養基，按規定條件培養14天。逐日觀察。

2.3.2對照組

另取7個濾筒，分別加入1ml相應的試驗菌，再加入相應等量培養基，作為對照，按規定條件培養14天，逐日觀察。

2.3.3供試品對照組

取供試品15支，溶于500ml0.9%的無菌氯化鈉溶液中，分別置于2個濾筒中過濾，沖洗濾膜數次，每次50ml，再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基，依照2010年版《中國藥典》二部無菌檢查法，按規定條件培養14天，逐日觀察。

2.3.4空白對照組

取試驗用硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基，按規定條件培養14天，逐日觀察。

2.3.5陰性對照組

取沖洗用0.1%蛋白胨緩沖液及0.9%的無菌氯化鈉溶液適量，分置于兩個濾筒中過濾，再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基，按規定條件培養14天，逐日觀察。

2.3.6培養

硫乙醇酸鹽流體培養基桶30～35℃培養；真菌培養基桶23～28℃培養，培養 14d。每天觀察并記錄。

結果表明，頭孢曲松鈉對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除。注射用頭孢曲松鈉采用薄膜過濾法進行無菌檢查時，緩沖液沖洗量以500ml/筒為宜，可以選擇大腸埃希菌或金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。

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