辣椒疫病生防菌的篩選、鑒定及其抑菌機理初探

摘要：采用平板稀釋法和平板對峙試驗，從武漢、荊州、宜昌和荊門等地的辣椒根際土壤中分離到185株細菌，篩選到1株具有高效拮抗辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生防菌Bs04。通過形態學觀察、生理生化指標測定、16S rDNA序列測定及進化樹構建，確定菌株Bs04為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。Bs04對辣椒疫霉菌絲生長抑制率達80%，同時對煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotiana）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sb. vesinfectum）和黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）具有明顯的抑制作用。利用光學顯微鏡觀察Bs04對辣椒疫霉菌絲形態的影響，發現菌絲分支增多、頂端畸形、原生質濃縮及生長緩慢等現象，表明Bs04具有顯著的抑菌作用。

關鍵詞：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）；生防菌；鑒定；抑菌機理

中圖分類號：S436 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1596-04

辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起，是重要的辣椒根莖病害之一，在中國及世界其他國家辣椒生產區發生嚴重，給辣椒生產造成巨大的經濟損失。對于辣椒疫病的防治大多采用化學防治，而大量使用化學藥劑導致了環境的嚴重污染，對消費者的身體健康產生了不利影響。目前，由于辣椒抗疫病品種較少，且多為中抗或不耐病品種，難以有效地控制辣椒疫病。因此，尋找安全有效的防治措施成為控制辣椒疫病的一個亟待解決的問題。

植物病害的生物防治是利用有益生物和生物代謝產物對植物病害進行有效防治的技術與方法，具有無毒、無害、無污染和高效等優點，受到了研究者的青睞。關于辣椒疫病的生物防治國內外均有相關研究報道[1-4]，但主要集中在生防菌的防效和應用上，對其控病機理研究卻較少。在此基礎上，針對湖北省辣椒疫病發生嚴重的狀況，本研究從辣椒根際土壤中分離生防菌株，并對其進行鑒定，初步探討生防菌的抑菌機理，為有效地防治辣椒疫病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養基

辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotiana）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sb. vesinfectum）、黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）均由長江大學生命科學院實驗室保存。培養基為牛肉膏蛋白胨培養基（NA）、馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）。

1.2 土樣采集和處理

從武漢、荊州、宜昌和荊門等辣椒種植區疫病發生嚴重的田地，利用五點采樣法從生長健康辣椒根際采集土樣。采樣時鏟去表層5 cm土層，取新鮮土樣500 g，用保鮮袋保存。稱取土樣10 g加入裝有90 mL無菌水的三角瓶中（內裝玻璃珠若干），30 ℃、120 r/min振蕩30 min，靜置后獲得土壤懸液。

1.3 生防細菌的篩選

將土壤懸液稀釋成10-5、10-6、10-7濃度，吸取不同稀釋度的土壤懸液100 μL涂布于NA培養基上，置于28 ℃培養48 h，挑取顏色、形態等不同的細菌單菌落并純化、保存。采用平板對峙法測定分離到的細菌對辣椒疫霉的抑菌活性。將辣椒疫霉菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（直徑6 mm），接種到PDA平板中央。培養1 d后，在距離辣椒疫霉菌塊2 cm處的4個對接點接種待測細菌，28 ℃培養，5 d后觀察抑菌結果，每個處理設3次重復。

1.4 拮抗菌株的鑒定

將篩選到的抑菌效果較好的菌株進行菌落形態觀察、顯微形態觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、水解淀粉試驗、甲基紅試驗（M.R）、V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、接觸酶反應試驗、明膠液化試驗、運動性試驗等主要形態和生理生化指標鑒定[5，6]。參照文獻[7]方法提取疑似枯草芽孢桿菌基因組DNA。根據已報道的枯草芽孢桿菌16S rDNA的保守區序列設計引物BsF（5′-TGCACACACCGCCCGT-3′）和BsR（5′-GGGTTGCCCCATTCG-3′），以枯草芽孢桿菌疑似株基因組為模板，進行PCR擴增。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經試劑盒純化后測序，將測序結果與GenBank數據庫中的序列進行對比分析，利用MEGA4.1軟件構建進化樹。

1.5 拮抗菌株的抑菌譜試驗

拮抗菌對各試驗病原真菌的拮抗作用均采用平板對峙法，各試驗重復3次。28 ℃下培養5 d后，測量抑菌帶的寬度和菌落半徑，計算拮抗菌對病原真菌生長的抑制率。對病菌生長的抑制率=（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100%。

1.6 拮抗菌株對辣椒疫病菌菌絲形態的影響

將辣椒疫病菌在PDA培養基上接種培養3 d后，用打孔器打取直徑5 mm的菌塊置于盛有20 mL PDA培養基的無菌培養皿中，28 ℃培養2 d。將培養好的辣椒疫病菌菌塊分別用拮抗菌株的無菌培養濾液和菌體懸浮液處理24 h后，以無菌水處理為對照，挑取菌絲在倒置顯微鏡下觀察其形態，每處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選結果

從健康辣椒根際土壤中共分離到185株細菌，從中挑取菌落形態、顏色與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相似的細菌48株。采用平板對峙法測定上述48株細菌的抑菌活性，結果表明有29株能夠抑制辣椒疫霉的生長，但抑菌程度不同。其中抑菌圈直徑為7.0～8.0 mm的有1株，為5.0～7.0 mm的有6株，為3.0～5.0 mm的有22株。編號為Bs04的菌株抑菌效果最強（圖1）。

2.2 拮抗菌株Bs04的鑒定結果

2.2.1 形態學和生理生化指標 菌株Bs04在NA平板上培養2 d后，菌落圓形或橢圓形，乳白色，中央凹陷，表面干燥，有褶皺，不透明。菌體為桿狀，大小為（0.7～0.8） μm×（2.0～3.0） μm，革蘭氏染色陽性，其他生理生化指標鑒定結果見表1。

2.2.2 16S rDNA序列與同源性分析 以拮抗菌株Bs04的基因組DNA為模板，用BsF和BsR為引物，進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測到1條大小約1 500 bp的清晰條帶（圖2），測序結果為1 538 bp。將測序結果在NCBI GenBank上進行序列比對（比對號lcl28017），發現其與枯草芽孢桿菌16S rDNA序列的相似性高達99%，初步確定拮抗菌株Bs04為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。將菌株Bs04的16S rDNA序列上傳GenBank，獲得基因序列號KF725636，并利用MEGA4.1軟件進行聚類分析，構建進化樹。由圖3可知，Bacillus subtilis（KF725636）與Bacillus subtilis（KC506778.1）處于一個小分支，同時與另外兩個枯草芽孢桿菌位于一個大分支。由此，進一步表明拮抗菌株Bs04為枯草芽孢桿菌。

2.3 對其他病原真菌的拮抗作用

為了研究拮抗菌株Bs04的生防潛力，采用平板對峙法對其抑菌譜進行了測定。結果表明，拮抗菌株Bs04對供試病原真菌有較高的拮抗活性。由表2可知，拮抗菌株Bs04對辣椒疫霉菌、煙草疫霉菌的抑制率達70%以上，對其他病原真菌的抑制率也在40%以上。表明菌株Bs04的抑菌譜寬，生防潛力較大，具有良好的應用前景。

2.4 對辣椒疫霉菌菌絲形態的影響

由圖4可知，用去離子水處理的辣椒疫霉菌絲形態飽滿，細胞壁光滑，菌絲能正常生長并擴展（圖4a）。經拮抗菌株Bs04菌體懸浮液和無菌濾液處理后，辣椒疫霉菌絲形態發生明顯變化，菌絲分支增多，頂端出現畸形，生長緩慢（圖4b與圖4c）；大多數菌絲還出現了細胞壁加厚，原生質濃縮呈球形或橢圓形的現象，菌絲中間出現許多類似厚壁孢子的細胞（圖4d）。

3 小結與討論

近年來，辣椒疫病發生日益嚴重，給中國的農業生產造成了較大的危害。對于辣椒疫病的防治，長期以來使用化學農藥進行防治，導致農藥殘留污染、增強病原菌的抗藥性等不利影響。辣椒疫病作為典型的土傳病害，應用生防菌對其進行防治則顯得至關重要。芽孢桿菌是一類重要的用于土傳性病害的生防細菌。多粘類芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌[8]等能夠抑制多種病原菌的生長，對其引起的病害起到一定的防治作用。

枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，具有生長快、營養要求簡單、對人畜無害、能夠抑制多種植物病害、不易產生抗藥性等優點，是目前應用廣泛的生防菌[9]。枯草芽孢桿菌能夠有效抑制玉米串珠鐮孢菌[10]、棉花枯萎病菌[11]、稻瘟病菌[12]等，其抗菌譜較廣。本研究通過平板稀釋法從辣椒根際土壤中分離到了枯草芽孢桿菌Bs04，采用平板對峙法發現其對辣椒疫霉菌具有較強的拮抗作用，且對其他多種病原真菌具有明顯的抑菌作用，具有較廣的抗菌譜，這與前人的研究結果一致[13-15]。同時，枯草芽孢桿菌Bs04顯著影響辣椒疫霉菌絲形態，能抑制菌絲的生長和擴展，阻止病原菌的進一步侵染。枯草芽孢桿菌作為目前應用較為廣泛的生防細菌之一，其主要通過根際定殖、分泌抗生素及拮抗蛋白等達到防病目的。本研究中菌株Bs04的防病機理有待進一步研究，而對于其在生產上的應用效果還有待于深入探索。

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