鉬藍(lán)比色法測定篤斯越橘成熟果實(shí)中還原型抗壞血酸含量及體系優(yōu)化

摘要：以篤斯越橘（Vaccinium uliginosum）成熟果實(shí)為試材，以鉬藍(lán)比色法測定篤斯越橘果實(shí)還原型抗壞血酸（Reduced ascorbic acid，AsA）含量進(jìn)行條件優(yōu)化。結(jié)果表明， 3%偏磷酸-乙酸用量為100 μL、5%硫酸和5%鉬酸銨用量均為200 μL、以去離子水補(bǔ)充至1 500 μL，30 ℃干熱恒溫浴顯色40 min，取出室溫下放置1 h后，在700 nm下測定，所得數(shù)據(jù)穩(wěn)定，準(zhǔn)確性適合用于篤斯越橘果實(shí)AsA含量的測定；測得含量為（40.20±6.23） mg/100 g FW。

關(guān)鍵詞：篤斯越橘（Vaccinium uliginosum）；鉬藍(lán)比色法；還原型抗壞血酸；測定與優(yōu)化

中圖分類號：O656.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1713-04

越橘屬植物超過450種[1]，廣泛分布于歐洲、北美洲、中美洲、非洲東南部中部及馬達(dá)加斯加島以及亞洲等地。篤斯越橘（Vaccinium uliginosum）為杜鵑花科越桔屬落葉灌木[2，3]，是我國一種野生種越橘[4]。篤斯越橘果可鮮食、也可加工，能夠提制天然食品色素，漿果酸甜，果汁含有VC、VE[5，6]、Zn、Cu等，具有很大的開發(fā)前景[6]。目前，關(guān)于越橘屬植物在抗性生理、光合生理、花色苷功能及分子生物學(xué)方面有較多研究[7]。對于越橘果實(shí)還原型抗壞血酸（AsA）含量的測定及相關(guān)方法鮮有報(bào)道。

抗壞血酸（VC）是人體必需的水溶性維生素，在許多新鮮水果、蔬菜中主要以還原型VC（AsA）存在[8]。

AsA含量的測定方法有很多，如2，6-二氯靛酚滴定法[9]、碘量法[10]、分光光度法[11]、紫外分光光度法[12]、高效液相色譜法[13]、鉬藍(lán)比色法[14，15]等。根據(jù)試驗(yàn)測定準(zhǔn)度和精度要求，選擇簡便易行、價(jià)格較低的測定方法。

本研究中，篤斯越橘藍(lán)色果實(shí)中花青素含量相對較高，不適合用2，6-二氯靛酚滴定法、碘量法進(jìn)行測定。此外，由于紫外分光光度法操作相對繁瑣、光電比濁法易受到亞錫離子干擾，因此兩種方法較少被采用；高效液相色譜法是極好的測定方法，能夠快速、準(zhǔn)確、簡便地測定果品中VC含量，但其儀器較為昂貴，很難應(yīng)用于普通實(shí)驗(yàn)室。鉬藍(lán)比色法實(shí)質(zhì)為分光光度法，通過試驗(yàn)條件優(yōu)化，探究出能夠準(zhǔn)確、簡便、快速地進(jìn)行越橘中AsA含量的測定方法，同時為相關(guān)果品測定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自吉林省汪清縣蘭家林場，篤斯越橘成熟果實(shí)采摘后放置于冰盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室，-70 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑與儀器 主要試劑：5%的鉬酸銨溶液；0.05 moL/L草酸-0.000 2 moL/L EDTA溶液；5%硫酸溶液；3%偏磷酸-乙酸溶液；1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)VC溶液。UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津制作所）；干熱恒溫器；真空泵。

1.2.2 試材處理 將試材從冰箱中取出，稱量20 g，倒入事先盛有一定量草酸-EDTA溶液研缽內(nèi)研磨，然后對研磨液進(jìn)行真空抽濾，濾液即刻用草酸-EDTA溶液定容至250 mL，放置4 ℃冰箱備用。

1.2.3 試驗(yàn)方法 參照文獻(xiàn)[14]方法，改進(jìn)如下：反應(yīng)體系總體積為1 500 μL，VC標(biāo)準(zhǔn)溶液-草酸-EDTA（或果汁待測液）500 μL、3%偏磷酸-乙酸100 μL、5%硫酸和5%鉬酸銨用量均為200 μL，剩余體積以去離子水補(bǔ)充；30 ℃干熱恒溫浴顯色40 min，取出室溫下放置40 min，700 nm波長條件下測定吸光度。

波長選擇試驗(yàn)：分別取0 μL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液（對照品）、50 μL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用上述方法并設(shè)定紫外可見分光光度計(jì)參數(shù)，掃描速度為中速；峰值檢測，閾值1、點(diǎn)4；在650～900 nm內(nèi)進(jìn)行掃描；各試劑用量試驗(yàn)，以0 μL 溶液為參比，吸光度調(diào)零，用量梯度為50 μL，范圍是50～250 μL；顯色溫度試驗(yàn)：溫度梯度為5 ℃，范圍是15～35 ℃；顯色時間及放置時間試驗(yàn)：時間梯度為10 min，前者范圍是10～50 min，后者范圍是0～90 min；精密度試驗(yàn)：取平行樣品，測定10次吸光度值；VC標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線制備：VC標(biāo)準(zhǔn)溶液用量梯度為10 μL，范圍是0 ～100 μL；加樣回收試驗(yàn)：加入50 μL VC標(biāo)準(zhǔn)溶液。（上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次測定的均值）

2 結(jié)果與分析

2.1 最適測定波長的選擇

在650～900 nm內(nèi)進(jìn)行掃描（如圖1），結(jié)果顯示，在693～702 nm內(nèi)有較大吸收值（0.636），參考文獻(xiàn)[14-16]中的結(jié)果，確定試驗(yàn)測定波長為700 nm。

2.2 偏磷酸-乙酸用量的確定

由圖2可以看出，在VC反應(yīng)體系中，偏磷酸-乙酸最適加入量為200 μL；然而，篤斯越橘反應(yīng)體系中，偏磷酸-乙酸最適加入量為初始值（50 μL），綜合考量，最終確定偏磷酸-乙酸用量為100 μL。

2.2 硫酸用量的確定

由圖3可以看出，向反應(yīng)體系中，加入5%硫酸的量為200 μL最適，因此，最終確定5%硫酸用量為200 μL。

2.3 鉬酸銨用量的確定

由圖4可以看出，在VC標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)體系中，5%鉬酸銨最適加入量為150 μL；在篤斯越橘反應(yīng)體系中，5%鉬酸銨溶液最適加入量為200 μL，綜合考慮，選取加入200 μL 5%鉬酸銨溶液為反應(yīng)體系最適量。

2.4 顯色溫度的確定

由圖5可以看出，反應(yīng)體系最適顯色溫度為30 ℃，最終，確定反應(yīng)溫度為30 ℃。

2.5 顯色時間的確定

由圖6可以看出，各反應(yīng)體系，在顯色40 min時顯現(xiàn)最大吸光度；雖然篤斯越橘果汁待測液顯色時間-吸光度曲線有一定波動，為了試驗(yàn)一致性，確定顯色時間為40 min。

2.6 顯色后放置時間的確定

由圖7可知，各反應(yīng)體系在顯色后60 min其吸光度較穩(wěn)定；因此，顯色反應(yīng)后放置60 min，然后測定其吸光度。

2.6 優(yōu)化試驗(yàn)精密度評價(jià)

按照“1.2.3”試驗(yàn)方法，做10次平行測定，結(jié)果如表1所示。VC標(biāo)準(zhǔn)溶液、篤斯越橘吸光度較穩(wěn)定，RSD≤2.0%，表明優(yōu)化后反應(yīng)體系的精密度良好。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與樣液VC含量的測定

按“1.2.3”的試驗(yàn)方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)VC加入量與吸光度的關(guān)系（如圖8），標(biāo)準(zhǔn)VC含量在0.006 7～0.040 0 ng/μg內(nèi)線性關(guān)系較好，服從朗伯-比耳定律，所得線性方程為y=0.123 1x-0.022 5（n=6），R2=0.994 8，方程擬合較好，能夠用于測定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

參照上述方法進(jìn)行吸光度值測定（n=5），結(jié)果見表2，平均回收率為80%～120%，RSD≤2.0%，說明試驗(yàn)準(zhǔn)確度良好。

3 小結(jié)與討論

采用鉬藍(lán)比色法測定果蔬中AsA含量，選取測定波長有所差異，由于反應(yīng)體系的不同，反應(yīng)最大波長會有所不同。在最適波長選取上，參考已有研究（700 nm[14]、700.1 nm[16]、705 nm[15]、746 nm[17]、760 nm[18]、820 nm[19]、839 nm[20]），結(jié)合圖像掃描，最終選取700 nm波長。鉬藍(lán)比色法能夠較好地應(yīng)用于篤斯越橘果實(shí)AsA含量的測定；篤斯越橘成熟果實(shí)（藍(lán)果）AsA含量為（40.20±6.23） mg/100 g FW）。

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