響應面法對甘薯莖葉綠原酸超聲提取工藝的優化

摘要：為優化甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]莖葉中綠原酸超聲提取工藝，在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇溶液體積分數、提取時間、料液比（g：mL，下同）3個對綠原酸提取率影響較大的因素，采用Box-Behnken中心組合試驗設計對各因素進行優化組合，運用Design Expert 8.05b軟件進行響應面回歸分析，建立了綠原酸提取率的二次多項式回歸方程。得到的優化組合條件為乙醇溶液體積分數70%、料液比1∶20、超聲時間24 min，綠原酸提取率為3.097 2%，與響應面擬合所得方程的預測值3.106 8%相近。試驗所用甘薯莖葉價廉易得，提取方法高效可行，分析方法可信，可為甘薯莖葉的開發利用提供依據。

關鍵詞：甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]莖葉；綠原酸；超聲提取；響應面分析

中圖分類號：S531 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2201-05

綠原酸具有較強的藥理活性，對消化、血液和生殖系統疾病有顯著療效。綠原酸是金銀花、杜仲等中藥材以及復肝寧、雙花注射液等中成藥的主要有效成分[1]，同時也是某些中藥制劑質量監控的重要指標之一[2]。除醫用外，綠原酸還可廣泛應用于保健食品、飲料[3]以及化妝品等領域[4]。目前，綠原酸主要是從金銀花[5，6]或杜仲[7，8]中提取，多數產品是浸膏，其含量為15%～30%。金銀花和杜仲是傳統中藥材，亦是食材，需求量大但資源量相對較少。以金銀花和杜仲為原料提取綠原酸，生產成本較高。研究表明[9]，甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]莖葉中含綠原酸，是甘薯莖葉主要活性成分之一。甘薯種植廣泛，其莖葉價格低廉，以其為原料提取綠原酸，可大大降低成本。目前，從甘薯莖葉中提取綠原酸的報道較少，并且多為正交設計[10，11]，不能考察各因素交互作用對綠原酸提取率的影響。本研究在單因素試驗的基礎上，通過3因素3水平Box-Behnken中心組合試驗，運用Design Expert 8.05b軟件進行響應面回歸分析，建立回歸模型，優化綠原酸提取的工藝條件，以期為甘薯莖葉資源的開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料 甘薯莖葉，采摘于廣西省柳州市，經清洗、曬干、烘干（60 ℃烘10 h）、粉碎過篩（40目）后備用。

1.1.2 主要試劑 綠原酸標準品（含量≥98%），天津光復精細化學品研究所；乙醇、鹽酸等均為分析純，國藥集團藥業股份有限公司。

1.1.3 儀器 UV-9600型紫外-可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；FA2004B型電子天平，上海越平科學儀器有限公司；KQ3200DA型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GZX-DH·400S型電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠原酸標準曲線的繪制 精確稱取0.005 0 g綠原酸標準品，用70%乙醇定容于100 mL的容量瓶中。準確移取0、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00 mL該溶液于25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容。采用紫外-可見分光光度計在200～400 nm波長對綠原酸對照品進行掃描，得出其最大吸收波長為328.8 nm，在328.8 nm波長處測定標準溶液的吸光度，以標準溶液質量濃度為橫坐標，測得的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線圖。擬合得到回歸方程為A=0.046 6C-0.005 1，R2=0.999 8。

1.2.2 綠原酸的提取工藝流程及測定 提取工藝：準確稱取一定量（過40目篩）干燥甘薯莖葉→按一定料液比加入提取劑→加HCl溶液調至pH 4→浸泡24 h→在室溫下超聲提取一定時間→抽濾→濾渣重復提取1次→合并2次濾液→定容（250 mL）。

綠原酸含量測定：準確移取提取液2.00 mL于25 mL容量瓶，按“1.2.1”的方法在328.8 nm處測定其吸光度。

綠原酸含量（g/mL）=（C×V1×N×V）/（V2×106）

式中，C為綠原酸濃度；V為提取液總體積；V1為取樣量；N為稀釋倍數；V2為待測溶液體積。

1.2.3 單因素試驗 分別以不同提取劑（水、甲醇、80%乙醇和丙酮）、乙醇溶液體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL，下同）、超聲時間（15、20、25、30、35 min）為因素，考察各因素對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響。

1.2.4 響應面設計 根據Box-Behenken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，選擇乙醇溶液體積分數（A）、料液比（B）和超聲時間（C）為自變量，甘薯莖葉綠原酸提取率（Y）為響應值，進行3因素3水平試驗設計（表1）。研究各個因素及其交互作用對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響，優化綠原酸提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同提取劑對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響 綠原酸是含有羥基和鄰苯二酚羥基的有機酸內酯，易溶于熱水、醇和丙酮。據此，選用水、甲醇、80%乙醇和丙酮作溶劑，考察在相同條件下對甘薯莖葉中綠原酸的提取效果，結果表明，水、甲醇、80%乙醇和丙酮作溶劑時，甘薯莖葉綠原酸提取率分別為2.01%、2.86%、2.73%、2.91%。

4種提取劑中，丙酮和甲醇的提取效果較好，但其本身有毒，價格也較貴。水是既清潔又價廉的提取劑，但其提取效果較差。乙醇的提取率雖然比丙酮和甲醇差，但也可基本滿足需求。由于廣西壯族自治區富產甘蔗，乙醇是糖廠的副產物之一，來源廣泛。因而，在后續試驗中，選用乙醇為綠原酸的提取溶劑。

2.1.2 乙醇溶液體積分數對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響 在其他條件相同的情況下，不同溶液乙醇體積分數對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響如圖1所示。當乙醇溶液體積分數小于70%時，隨乙醇溶液體積分數的增加，綠原酸提取率增大，乙醇溶液體積分數為70%時達到最高值2.95%；之后隨乙醇溶液體積分數的增大，綠原酸提取率減少。這可能是由于乙醇溶液體積分數過低，綠原酸溶出不完全，而溶液體積分數過高，一些脂溶性的雜質也隨之溶出。因此，在后續單因素試驗中，乙醇溶液體積分數選擇70%。

2.1.3 料液比對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響

由圖2可知，當料液比低于1∶20時，甘薯莖葉綠原酸的提取率隨溶劑量的增加而增加，說明溶劑用量的多少對提取率有較大影響。溶劑量較少時，細胞內外的濃度差較大，有利于乙醇快速滲透到細胞內部，因而隨溶劑量增加，綠原酸溶出增加，提取率逐漸增大。當料液比為1∶20時達到溶解平衡，這時綠原酸提取率達到最大。隨后，料液比增大，綠原酸提取率變化不大。因而，選取1∶20的料液比進行后續的單因素試驗。

2.1.4 超聲時間對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響 超聲波具有空化效應、機械效應和熱效應[5]，能快速破壞植物細胞，使其內部的化學成分較快溶出。由圖3可知，隨著超聲時間的延長，甘薯莖葉綠原酸的提取率先增加，當超聲時間為25 min時達到最大值，隨后有所降低。這可能是隨著超聲時間的增加，植物細胞被破壞的數目增多，細胞內釋放出的化學成分增多，在提取劑中逐漸達到擴散、溶解平衡時，即綠原酸提取率達到最大值。由于綠原酸的鄰二酚羥基結構不穩定，超聲時間過長，會導致部分綠原酸被氧化破壞。而且，超聲時間的延長，使可溶性成分如糖等也有較多溶出，使后期工藝操作困難，綠原酸有所損耗。因此，超聲提取的時間以25 min為宜。

2.2 響應面分析法優化甘薯莖葉綠原酸提取工藝

2.2.1 Box-Behnken設計方案及結果 在單因素試驗基礎上，根據Box-Benhnken試驗設計原理，選取乙醇溶液體積分數、料液比、超聲時間為自變量，綠原酸提取率為響應值，進行3因素3水平響應面試驗設計，結果如表2所示。

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析 對表2試驗結果運用Design Expert 8.05b軟件程序進行二次回歸響應面分析，建立多元二次響應面回歸模型為Y=3.10-2.500×10-3A+0.060B-0.053C-0.088AB-0.087AC+0.083BC-0.21A2-0.17B2-0.12C2。

對表2數據進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數，結果見表3。由表3可知，該二次回歸方程整體模型極顯著，表明該試驗方法可靠。該模型回歸系數R2=0.992 7>0.9，表明該模型的相關度較好。方程失擬項小，R2Adj=0.983 3，變異系數（Coefficient of variation，CV）=0.83。該模型與實測值能較好地擬合，可以用于綠原酸提取條件的分析和預測。各因素對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響大小為B>C>A，即料液比>超聲時間>乙醇溶液體積分數。

2.2.3 交互作用分析 在一個因素不變的情況下，考察其他兩個因素對甘薯莖葉綠原酸提取率的影響。經Design Expert 8.05b軟件分析，交互項AB、AC、BC對綠原酸提取率均有極顯著影響，所得到的響應面及等高線圖如圖4所示。

2.2.4 最優化條件確定 采用Design Expert 8.05b軟件預測的甘薯莖葉綠原酸提取的最優化條件為乙醇溶液體積分數70.03%、料液比1∶20.68（g∶mL）、超聲時間24.09 min，在此條件下，綠原酸提取率為3.106 8%。為了檢驗該預測是否準確，兼顧實際操作的方便，將最佳工藝條件修正為乙醇溶液體積分數70%、料液比1∶20（g∶mL）、超聲時間24 min，在此條件下進行3次平行試驗，實際測得綠原酸提取率的平均值為3.097 2%，與預測值相差不大。因此，利用響應面法優化甘薯莖葉中綠原酸超聲提取工藝是可行的，具有良好的應用價值。

3 小結

采用超聲輔助法從甘薯莖葉中提取綠原酸，對甘薯莖葉資源的開發利用具有較大的現實意義。通過響應面法分析優化其提取工藝，建立多元二次響應面回歸模型Y=3.10-2.500×10-3A+0.060B-0.053C-0.088AB-0.087AC+0.083BC-0.21A2-0.17B2-0.12C2。該模型能較準確地預測甘薯莖葉中綠原酸的提取率。

通過響應面分析法優化確定甘薯莖葉中綠原酸提取的最佳工藝條件為乙醇溶液體積分數70%、料液比為1∶20、超聲時間24 min，在此條件下進行3次試驗，實際測得綠原酸提取率的平均值為3.097 2%，與預測值相差不大。試驗所用甘薯莖葉來源廣泛，價格低廉，采用超聲提取法提取甘薯莖葉中綠原酸具有省時、高效、清潔、提取率高的優點。

參考文獻：

[1] 林啟壽.中草藥成分化學[M].北京：科學出版社，1977.

[2] 羅思齊.中草藥活性成分含量測定概述[J].醫學教育探索，1989（9）：19-26.

[3] 劉軍海，裘愛泳.綠原酸及其提取純化和應用前景[J].糧食與油脂，2003（9）：44-46.

[4] 馬建華，錢素平，林維真，等.綠原酸對脫氧鳥苷酸氧化性羥基加合物的快速修復[J].中國科學（B輯），1998，28（6）：561-565.

[5] 宣 寒，謝發之.響應面法優化金銀花中綠原酸的超聲提取工藝[J].應用化工，2010，39（10）：1474-1477，1501.

[6] 楊 茉，周 晶，張慶偉，等.酶法輔助提取金銀花中綠原酸的工藝研究[J].中成藥，2009，31（7）：1128-1130.

[7] 王 茜，李 智，何 琦，等.杜仲葉中綠原酸提取分離工藝條件的研究[J].離子交換與吸附，2008，24（1）：73-80.

[8] 李劍敏，衛兵兵，陳志紅.微波強化提取杜仲葉中綠原酸的工藝研究[J].應用化工，2006，35（4）：243-245.

[9] ISLAM M S，YOSHIMOTO M， YAMAKAWA O.Distribution and physiological functions of caffeoylquinic acid derivatives in leaves of sweetpotato genotypes[J]. Journal of Food Science，2006，68（1）：111-116.

[10] 王麗萍，徐傳遠.酶-超聲波法提取紅薯莖葉中綠原酸的工藝研究[J].湖北農業科學，2012，51（12）：2574-2575，2585.

[11] 李文芳，晏 麗，田春蓮，等.甘薯葉中綠原酸最佳提取工藝的研究[J].食品科學，2007，28（11）：245-248.