蘋果砧木山定子MbNas1的克隆、表達與亞細胞定位

摘要：以蘋果砧木山定子（Malus baccata）為試材，根據小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）中克隆得到的尼克煙酰胺合成酶基因MxNas1（登錄號：DQ403256）的全長序列設計特異引物，通過RT-PCR方法從山定子cDNA中克隆到Nas1基因并命名為MbNas1，該基因全長為978 bp。預測該基因可編碼325個氨基酸，理論等電點為5.26，相對分子質量為36.09 ku。Real-time PCR結果表明，正常供鐵（EDTA-NaFe，40 μmol/L）時，該基因在山定子水培苗的新葉、老葉、根、莖的韌皮部中均有表達，在木質部表達量較低；缺鐵處理（4 μmol/L）時，該基因在根和新葉中的表達加強，第6天達到最高值，之后開始下降；在老葉中表達逐漸減弱；高鐵處理（160 μmol/L）時，該基因在根和新葉中的表達減弱，在第9天達到最小值，之后有所上升；在老葉中表達逐漸增強。基因槍亞細胞定位試驗表明，MbNas1蛋白質定位在細胞質膜上。

關鍵詞：山定子（Malus baccata）；尼克煙酰胺合成酶基因（MbNas1）；表達分析；亞細胞定位

中圖分類號：Q7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2260-04

鐵是植物生長發育過程不可或缺的微量營養元素之一，缺鐵可導致缺鐵失綠癥——黃葉病，使光合作用降低，嚴重影響作物的產量和質量[1]。鐵元素還存在著不穩定性，過量對細胞有毒害，因而在植物體內必須與別的物質螯合才能進行運輸和分配[2]。高等植物韌皮部和嫩葉中尼克煙酰胺作為主要的鐵螯合物參與鐵的運輸過程[3]，而尼克煙酰胺合成酶（Nas）基因作為主要的限制酶基因在整體的調控中起到了重要的作用。近年來，Nas基因已陸續在大麥、水稻、玉米、擬南芥、番茄和蘋果砧木小金海棠中被分離出來，成為研究的熱點。

山定子（Malus baccata）作為常用的優良蘋果砧木，耐寒、耐鹽堿、根系發達，但以山定子為砧木的蘋果樹在缺鐵的條件下易發生缺鐵失綠癥[4]，屬于鐵低效基因型品種，而小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）則為鐵高效基因型蘋果砧木[5]，前期已從小金海棠中克隆到了尼克煙酰胺合成酶基因MxNas1，研究發現鐵脅迫處理影響該基因的表達[3]。為了探明不同鐵效率的蘋果砧木中Nas基因表達情況的區別以及對鐵脅迫處理反應的差異，本試驗從山定子中克隆到Nas1基因并分析其在鐵脅迫處理下的表達模式，進而為研究植物抗性機理及鐵低效砧木的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

山定子組培苗的組織培養和水培方法參照張柳霞等[6]的方法。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 待水培苗長出10～12片真葉時進行缺鐵脅迫處理（EDTA-NaFe，4 μmol/L）和高鐵處理（EDTA-NaFe，160 μmol/L）。取正常供鐵處理條件下水培苗的新葉（頂端第1～2片未完全展開的葉子）、老葉（頂端數第9～10片完全展開的葉子）、白色新生根、韌皮部和木質部，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用；在缺鐵處理和高鐵處理的0、1、3、6、9 和12 d 后，分別取缺鐵和高鐵處理條件下水培苗的新葉、老葉、白色新生根，液氮速凍后置于 -80 ℃冰箱保存備用。其中木質部和韌皮部的取材方法采用Han等[7]的方法。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成 采用改良的CTAB法[8]對不同組織的總RNA進行提取。用1 μL總RNA和1 μL反轉錄酶合成cDNA第一條鏈。

1.2.3 基因全長的獲得 根據蘋果砧木小金海棠的MxNas1基因（登錄號：DQ403256）全長設計特異性引物F1（5′-ATGTGTTGCCAGGGAGATGCT-3′）、R1（5′-TTAAAGCTGCTCCTCGAAGGC-3′）進行RT-PCR 擴增。PCR 擴增體系（50 μL）：高保真DNA聚合酶1 μL（5U/μL），ddH2O 21 μL、2×HiF Mix（0.5 U/μL）25 μL、上、下游引物（10 mmol/L）各1.0 μL和模板1.0 μL。PCR 全長擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化后連接到pEASY-T1 Simple 載體上，轉化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，陽性克隆菌液送北京六合華大基因公司測序。

1.2.4 MbNas1基因的序列分析 利用DNAMAN 5.2 軟件將測序獲得的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，并預測該蛋白質的相對分子質量和理論等電點；利用http：//www.ncbi.nlm.nih 網站進行MbNas1基因的氨基酸和核苷酸相似性分析，并從中挑選了葡萄、百脈根、蓖麻、小金海棠、金冠、草莓、橙子等來源于不同植物編碼的尼克煙酰胺合成酶Nas基因的氨基酸序列，將這些序列與山定子尼克煙酰胺合成酶基因的氨基酸序列進行比對，然后構建同源進化樹。

1.2.5 MbNas1基因的實時熒光定量PCR分析 將cDNA 稀釋5倍后取2 μL 進行熒光定量PCR，所用染料為IQ SYBR Green Supermix（購自大連寶生物工程有限公司）， 采用7500 Real-time PCR System （ABI）進行測定， 用一步法進行擴增，以β-actin 為內參。PCR擴增體系（20 μL）：cDNA 模板（25 ng/μL） 2 μL，上下游引物（10 μmol/L） 各0.3 μL，SYBR Green Super Mix 10 μL，染料ROX 0.4 μL為內參，ddH2O 7 μL；反應條件為95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，55 ℃ 34 s，40 個循環。所用引物序列如表1所示。

1.2.6 MbNas1基因亞細胞定位 在基因開放閱讀框的兩端加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，之后用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切MbNas1的PCR產物和pEZS-NL質粒，將MbNas1基因插入到pEZS-NL載體的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點之間，構建MbNas1-GFP的瞬時表達載體。采用基因槍法將含有對照質粒和MbNas1-GFP 質粒的金粉轟擊到洋蔥表皮細胞中，置于MS培養基上28 ℃培養24 h。利用掃描共聚集熒光顯微鏡（Nikon-ECLIPSE 80i型）觀察洋蔥表皮的熒光情況[9]。

2 結果與分析

2.1 MbNas1基因的克隆

以山定子正常供鐵條件下葉的cDNA為模板，PCR擴增獲得MbNas1基因的全長，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，得到的條帶大小約978 bp（圖1）。

2.2 MbNas1基因生物信息學分析

利用在線軟件分析表明，MbNas1基因編碼325個氨基酸，相對分子質量為36.09 ku，理論等電點為5.26，其cDNA序列及預測編碼的氨基酸序列如圖2所示。

2.3 同源性分析

利用DNAMAN 5.2軟件將MbNas1基因的氨基酸與來自葡萄、百脈根、蓖麻、小金海棠、金冠、草莓、橙子的尼克煙酰胺合成酶的氨基酸序列進行比對，各序列之間存在著不同程度的差異（圖3A）。根據氨基酸序列比對結果，利用DNAMAN 5.2軟件構建了山定子MbNas1與葡萄、百脈根、蓖麻、小金海棠、金冠、草莓、橙子等物種間的尼克煙酰胺合成酶同源進化樹（圖3B），所選物種Nas氨基酸的同源性均在82%～98%之間，其中山定子MbNas1與小金海棠親緣關系最近，同源性為98%；其次是金冠，同源性為92%；再次是草莓和橙子，同源性分別為87%、86%；而與葡萄、百脈根、蓖麻等其余物種的親緣關系稍遠。

2.4 MbNas1基因的表達特性分析

取山定子正常供鐵處理后根、新葉、老葉、韌皮部、木質部的總RNA進行Real-time PCR分析（圖4A）：正常供鐵時，MbNas1基因在山定子的根、新葉、老葉、韌皮部中均有表達，在木質部中表達量較低。分別提取山定子缺鐵和高鐵處理0、1、3、6、9、12 d的根、新葉、老葉的總RNA，進行Real-time PCR分析（圖4B、4C），缺鐵處理（4 μmol/L）時，隨處理時間的增加，該基因在根和新葉中的表達先加強后減弱，第6天時達到最高值，之后開始下降；在老葉中表達逐漸減弱。高鐵處理（160 μmol/L）時，隨處理時間的增加，該基因在根和新葉中的表達逐漸減弱，在第9天達到最小值，之后有所上升；在老葉中表達逐漸增強。

2.5 MbNas1的亞細胞定位

利用基因槍法將對照35S：GFP質粒和重組質粒MbNas1-GFP轉入到洋蔥表皮細胞中，在顯微鏡下可觀察到，對照洋蔥表皮細胞整個細胞均有綠色熒光出現，而MbNas1-GFP 綠色熒光僅存在洋蔥表皮細胞的細胞膜上（圖5）。表明，MbNas1蛋白質已經定位在細胞膜上。

3 小結與討論

蘋果砧木山定子極其耐寒，但屬于鐵低效基因型植物，在缺鐵的條件下，以山定子為砧木的蘋果樹極易發生黃化現象，本試驗首次從山定子中克隆到尼克煙酰胺合成酶基因，命名為MbNas1，對該基因所編碼的氨基酸序列進行預測，并與小金海棠、金冠、草莓等其他物種尼克煙酰胺合成酶基因表達的序列進行比對，發現其同源性很高，因此認為MbNas1基因屬于尼克煙酰胺合成酶基因家族的一員。通過洋蔥表皮亞細胞定位試驗發現，MbNas1基因編碼的蛋白質已定位在細胞膜上。

利用Real-time PCR分析了正常供鐵條件下MbNas1基因在山定子的根、新葉、老葉、韌皮部和木質部中的表達情況，發現在新葉中該基因表達量最高，其次是根和老葉。利用Real-time PCR分析在缺鐵脅迫和高鐵處理的條件下，該基因在根、新葉和老葉中的表達情況，結果表明缺鐵能夠影響MbNas1基因在山定子內的表達，即該基因能夠對外界鐵脅迫的環境作出應答反應。隨著缺鐵時間的延長，根和新葉中MbNas1基因的表達趨勢均為先上升后下降，老葉中表達逐漸減弱。在缺鐵脅迫下，植物可以通過促進尼克煙酰胺的合成來增加鐵的吸收，而加強MbNas1基因的表達可以促進尼克煙酰胺的合成，從周圍環境中吸收更多的鐵。從本試驗結果中可以看出，缺鐵處理6 d 后MbNas1基因的表達開始呈下降趨勢，可能當尼克煙酰胺積累到一定程度后，MbNas1基因表達趨勢減緩。在高鐵處理條件下，山定子不需要通過合成更多的尼克煙酰胺來增加鐵的吸收，因此，不需要增強MbNas1基因的表達。

研究結果表明，低鐵脅迫可使小金海棠和山定子中尼克煙酰胺的含量上升，但小金海棠中尼克煙酰胺的含量上升得較快且幅度較大[10]。本試驗也證實缺鐵脅迫時山定子與小金海棠中Nas1基因的表達趨勢有較大的區別。在分析小金海棠尼克煙酰胺合成酶基因MxNas1在缺鐵條件下的表達時，發現根中MxNas1基因的表達量在缺鐵處理24 h時達到最高[3]，而本試驗中的MbNas1基因的表達量在缺鐵處理第6天才達到最高，這與測定的小金海棠和山定子中尼克煙酰胺合成酶含量變化趨勢一致，而這種Nas1基因表達模式和反應速度的差異可能是導致山定子和小金海棠對鐵應答速度不同的原因之一。

參考文獻：

[1] HAN D G，WANG Y，ZHANG L，et al.Isolation and functional characterization of MxCS1：A gene encoding a citrate synthase in Malus xiaojinensis[J]. Biologia Plantarum，2012，56（1）：50-56.

[2] KRUGER C，BERKOWITZ O，STEPHAN U W，et al.A metal-binding member of the late embryogenesis abundant protein family transports iron in the phloem of Ricinus communis L.[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277（28）：25062-25069.

[3] HAN D G，YANG G H，XU K D，et al.Overexpression of a Malus xiaojinensis Nas1 gene influences flower development and tolerance to iron stress in transgenic tobacco[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2013，31：802-809.

[4] 張凌云，翟 衡，張憲法，等.蘋果砧木鐵高效基因型篩選[J].中國農業科學，2002，35（1）：68-71.

[5] HAN Z H，SHEN T，Korcak R F，et al.Iron absorption by iron-efficient and inefficient species of apples[J]. Journal of Plant Nutrition，1998，21（1）：181-190.

[6] 張柳霞，王 憶，朱 斌，等.蘋果屬山定子檸檬酸合成酶基因（MbCS1）的克隆及表達分析[J].農業生物技術學報，2012，20（9）：1028-1034.

[7] HAN D G，SHI Y，WANG B，et al.Isolation and preliminary functional analysis of MxCS2：A gene encoding a citrate synthase in Malus xiaojinensis[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2015，33（1）：133-142.

[8] 張玉剛，成建紅，韓振海，等.小金海棠總RNA提取方法比較及cDNA的LD-PCR擴增[J].生物技術通報，2005，177（4）：50-53.

[9] XU H M，WANG Y，CHEN F，et al.Isolation and characterization of the iron-regulated MxbHLH01 gene in Malus xiaojinensis[J].Plant Molecular Biology Reporter，2011，4（29）：936-942.

[10] 韓德果.小金海棠MxCS1基因的克隆與功能分析及CA和NA在鐵轉運中的作用[D].北京：中國農業大學，2010.