石仙桃中總黃酮的提取及含量測定

摘要：采用單因素試驗及正交試驗設計，利用乙醇溶劑浸提結合微波輔助提取法對石仙桃（Phoidotaof chinensis Lind L.）總黃酮的提取工藝進行優化，并用分光光度計比色法測定提取的總黃酮含量。結果表明，石仙桃總黃酮提取的最佳工藝條件為微波功率300 W，提取時間30 min，溫度60 ℃，料液比（m∶V，g∶mL）1∶20，乙醇體積分數80%。按照最佳工藝條件進行提取，石仙桃總黃酮提取量達31.41 mg/g。

關鍵詞：石仙桃（Phoidotaof chinensis Lind L.）；總黃酮；提取工藝；含量測定；正交試驗

中圖分類號：Q949.71+8.43；O657.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2157-03

石仙桃系蘭科石仙桃屬植物石仙桃（Phoidotaof chinensis Lindl.）的全草，俗稱石上蓮、石橄欖、石穿盤等，始載于《生草藥性備要》。其性甘味涼，具有養陰、清熱、利濕消瘀的功效，民間常用來治療高血壓病、頭暈和各種原因引起的頭痛[1]。石仙桃屬植物全球約30種，中國有14種，產于南方，尤以西南地區多見[2]。研究[3]表明，石仙桃主要化學成分為萜類、酚類、木脂素類、黃酮類，多糖等。目前石仙桃化學成分的定量研究主要是對揮發油等的研究[4，5]，目前尚未發現對石仙桃總黃酮提取工藝的研究。為此采用微波提取法提取石仙桃總黃酮，以石仙桃總黃酮提取量為考察指標，通過單因素試驗和正交試驗，探究微波法提取石仙桃總黃酮的最佳工藝，旨在為石仙桃進一步研究和資源開發利用提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

石仙桃全草采自贛南；蘆丁對照品由北京恒元啟天化工技術研究院提供。

WF-4000C型常壓微波快速反應系統（上海屹堯分析儀器有限公司）；λ-35型紫外可見分光光度計（美國鉑金埃爾默公司）；DZF-6050型烘箱（上海一恒科技有限公司）；ABl35-S型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 稱取蘆丁對照品2.70 mg，用體積分數70%的乙醇溶解，10 mL容量瓶定容至刻度，配成0.27 mg/mL蘆丁對照品溶液，分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL具塞試管中，加水至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻放置6 min，加10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻放置6 min，加4%氫氧化鈉3.0 mL，搖勻， 加水至刻度，搖勻放置15 min。另取一10 mL具塞試管，不加對照品溶液，只加顯色劑，按照上法制成空白對照。采用紫外可見分光光度計在510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。標準曲線：A=12.971 C-0.0076，r=0.999 6，A表示吸光度，C表示蘆丁溶液濃度。蘆丁溶液濃度C在0.010 8～0.0648 mg/mL范圍內與吸光度A有良好的線性關系。

1.2.2 微波法提取石仙桃總黃酮 稱取2.000 g石仙桃粗粉至500 mL微波提取罐中，一定條件下提取，減壓抽濾，回收濾液至少量，用70%乙醇定容至50 mL，制成待測溶液。取待測溶液5 mL， 加入15 mL 70%乙醇，搖勻，即稀釋4倍。取稀釋液2 mL，按“1.2.1”方法顯色，制成10 mL顯色液及空白對照，在510 nm下測定其吸光度A，按回歸方程計算出樣品溶液中的總黃酮含量（mg/mL），根據稀釋倍數及樣品質量換算出樣品中總黃酮的含量（mg/g）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 微波提取功率對石仙桃總黃酮提取量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按液料比（V/m，下同）20∶1，乙醇體積分數70%，提取時間15 min，提取溫度70 ℃，分別在功率100、200、300、400、500、600、700 W條件下提取石仙桃總黃酮，結果見圖1（圖中數據為3次重復的平均值，下同）。從圖1可以看出，當微波功率小于300 W時，總黃酮提取量隨微波功率增大而增加，當微波功率大于300 W時，總黃酮提取量隨微波功率增大而減小，這主要是因為當微波功率較低時，通過吸收微波能量產生熱量的極性分子吸收的能量少，產生的熱量低，細胞內溫度上升得慢，液態水氣化產生的壓力小，細胞膜的破碎度低，導致總黃酮的提取量低，隨著功率的增大，細胞膜的破碎程度不斷增大，總黃酮的提取量也隨之增大，但細胞膜的破碎度不可能無限增大，當微波功率繼續增大時，總黃酮可能會分解，其他雜質的溶解也會增加，故后續試驗微波功率選定300 W。

2.1.2 微波提取時間對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，液料比20∶1，乙醇體積分數70%，提取溫度70 ℃，分別在時間10、15、20、25、30、35、40 min條件下提取石仙桃總黃酮，結果見圖2。從圖2可以看出，當提取時間低于30 min時，石仙桃總黃酮提取量隨提取時間的增加而增大，當提取時間超過30 min時，石仙桃總黃酮提取量隨提取時間的增加而減少。這可能是因為加熱時間較短時，細胞內極性分子吸收的微波能量較少，液態水氣化產生的壓力較小，對細胞膜被破壞的程度較小，故總黃酮提取量不高；隨著時間的延長，細胞內極性分子吸收的微波能量增加，液態水氣化產生的壓力增大，細胞膜被微波破壞程度加大，但時間過長，雜質的溶解也會增加，乙醇揮發量增加，總黃酮提取量下降，因此確定后續試驗提取時間為30 min。

2.1.3 提取溫度對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時間30 min，液料比20∶1，乙醇體積分數70%，分別在溫度40、50、60、70、80、90 ℃條件下提取石仙桃總黃酮，結果見表1。從表1可以看出，60 ℃時石仙桃總黃酮含量最高，80 ℃時石仙桃總黃酮含量次之。

2.1.4 液料比對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時間30 min，溫度60 ℃，乙醇體積分數70%，分別在液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1條件下提取石仙桃總黃酮，結果見圖3。從圖3可以看出，當液料比低于20∶1時，石仙桃總黃酮提取量隨液料比的增加而增大，當液料比高于20∶1時，石仙桃總黃酮提取量隨取液料比的增加而減少。

2.1.5 乙醇體積分數對石仙桃總黃酮含量的影響 稱取石仙桃樣品2.000 g，按微波功率300 W，提取時間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，分別在乙醇體積分數為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%條件下提取石仙桃總黃酮，結果見圖4。從圖4可知，當乙醇體積分數低于80%時，石仙桃總黃酮提取量隨乙醇體積分數的增加而增大，當乙醇體積分數高于80%時，石仙桃總黃酮提取量隨取乙醇體積分數的增加而減少。這是因為在植物中，黃酮類化合物多以苷類形式存在，黃酮苷元極性較小，糖基極性較大，根據相似相溶原理，隨著乙醇體積分數的增大，部分酯溶性黃酮溶解量增加。但當乙醇體積分數較高時，水溶性黃酮的溶解度降低，并且乙醇體積分數較高會使細胞蛋白質很快凝固，不利于乙醇向細胞內滲透，溶解并釋放細胞內黃酮類物質，使總黃酮提取率下降。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 微波提取石仙桃總黃酮的正交試驗設計 在單因素試驗基礎上，為進一步考察各因素對石仙桃總黃酮提取量影響程度，以及得出微波提取石仙桃總黃酮的最佳工藝條件，由于微波功率較低時，即300 W左右時，石仙桃的提取量已較高，為節約能源，將微波提取的最佳功率定為300 W。故只選擇提取時間、溫度、液料比、乙醇體積分數這4個因素為主要影響因素，進行四因素三水平的正交試驗，選用L9（34）正交表探究提取時間、溫度、液料比、乙醇體積分數對石仙桃總黃酮含量的影響程度大小及微波提取法的最佳工藝條件。L9（34）正交試驗結果及極差分析結果見表2。

由表2正交試驗數據可知，在微波功率為300 W條件下，各因素對石仙桃總黃酮含量的影響從大到小為乙醇體積分數、提取時間、溫度、液料比。由表2極差分析可知，石仙桃總黃酮含量的最佳工藝條件為A2B2C2D2，即微波功率為300 W，時間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，乙醇體積分數為80%。

2.3 最佳工藝條件的驗證性試驗

精確稱取石仙桃樣品2.000 g，在最佳工藝條件A2B2C2D2下，按“1.2”的試驗方法操作，測定吸光度，并計算石仙桃總黃酮提取量。進行3次平行驗證性試驗，得到的驗證結果為在最佳工藝條件下，總黃酮的提取量為31.41 mg/g，RSD為0.85%。說明該工藝條件穩定可行。

3 小結

在中草藥中黃酮類化合物提取方法主要有浸漬法、回流提取法、超聲提取法、微波提取法等。相比之下，微波法具有提取效率高、節省溶劑、污染小等優點。微波法提取石仙桃總黃酮的工藝研究，單因素試驗得出的最佳條件為微波功率為300 W，時間30 min，溫度60 ℃，液料比20∶1，乙醇體積分數為80%，對時間、溫度、液料比、乙醇體積分數這4個因素進行四因素三水平正交試驗后，得出的結果與單因素試驗結果一致，且測定的黃酮含量的方法穩定可靠，總黃酮的提取量可達31.41 mg/g。

參考文獻：

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