肉鴿H9亞型禽流感的診斷與病毒分離及鑒定

摘要：通過分子PCR檢測，初步證明在湖北一發病肉鴿群感染H9亞型禽流感病毒。病原分離后，盲傳3代，其血凝效價達到109～1011，經生物學特性進行測定，其雞胚半數致死量為107.5， 9日齡雞胚平均致死時間為 54.3 h，1日齡雛雞腦內接種致病指數為1.8，6周齡小雞靜脈接種致病指數為2.0，證明該 H9亞型禽流感為毒力較強。將該病毒回歸非免疫肉鴿，能產生典型的H9亞型禽流感癥狀，采集其肺、喉頭、泄殖腔等病變組織進行病毒分離，均可分離到H9亞型AIV。

關鍵詞：肉鴿；H9亞型禽流感病毒；分離

中圖分類號：S836 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2170-03

H9亞型禽流感（Avian influenza，AI）是持續危害中國及世界養禽業發展的重要禽類傳染病之一。禽類感染H9亞型禽流感病毒后，常表現為呼吸道疾病、產蛋量降低、急性死亡等多種形式[1]。雖然對禽的致病率低，但可引起生產性能下降，造成免疫抑制，因而在普遍存在復合感染的情況下，對養禽業造成的經濟損失也很大。同時H9N2亞型禽流感病毒還可感染人，提供內部序列與H5N1亞型禽流感病毒重組；并且具有人流感病毒的受體結合位點[2]，因此研究H9N2亞型AI的病原及防控對養禽業持續健康發展具有重要意義。

1994年陳伯倫等[3]首次報道從中國廣東某雞群分離到H9亞型AIV以來，陸續的有文獻報道在各類雞、鴨、鵪鶉等養殖場有H9亞型AIV發生和流行，給養禽業造成了巨大的經濟損失。2014年12月，湖北一肉鴿場1月齡肉鴿出現食欲下降、羽毛蓬松、精神不振、頭頸歪斜或頭扭轉置于背上呈觀星狀等典型的神經癥狀，死亡率為15%，疑似新城疫或禽流感癥狀。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用SPF雞胚購自北京梅里亞公司；試驗鴿由湖北某鴿場提供。抗新城疫陽性血清、抗禽流感陽性血清（H5N1、H9N2）、抗減蛋綜合征（EDS76）陽性血清由湖北省農科院畜牧獸醫研究所制備和保存。

1.2 病料的采集與處理

病料采自湖北某肉鴿場，鴿群日齡26～45日齡。取病變嚴重的氣管、喉頭和肺臟，剪碎，加2倍的PBS溶液和終濃度為2 000 IU/ml的雙抗，研磨后，反復凍融2次，置-20 ℃冰箱備用。

1.3 病料的初步檢測

參照GenBank公布的NDV、H9亞型禽流感病毒基因組序列Primer primere5.0軟件設計NDV，引物為：NDV-F-U CCTTGGTGAITCTATCCGIAG，NDV-F-D CTGCCACTGCTAGTTGIGATAATCC，長度254 bp；禽流感H9（H9AIV）：HA基因檢測引物H9N2-HA-U CTCCACACAGAGCAYAATGG，H9N2-HA-D GYACACTTGTTGTTGTRTC，長度488 bp。引物合成由生物工程（上海）有限公司完成。

1.4 0.85%雞紅細胞制備

取SPF公雞血 5 mL，加 入抗凝劑 ，生理鹽水沖洗，1 500 r/min 離心7 min，反復操作3次，制備雞紅細胞懸液 。

1.5 病毒分離

取反復凍融后的上清液接種9日齡雞胚，每枚雞胚接種0.25 mL，37 ℃孵化120 h ，24 h內死胚棄去，取 24～120 h死亡的雞胚，觀察雞胚病變，收獲雞胚有明顯病變的尿囊液，測定尿囊液是否有血凝性，檢測有無細菌污染，并盲傳3代，測其血凝效價（HA）。

1.6 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗

按常規β-微量法進行尿囊液血凝效價（HA），并以抗NDV、抗禽流感（H5N1、H9N2）、抗減蛋綜合征（EDS）陽性血清進行 HI 反應。

1.7 動物回歸試驗

用分離的病毒尿囊液0.2 mL，分別對20只30日齡非免疫肉鴿進行點眼、滴鼻。觀察10 d，每日記錄發病和死亡情況，剖檢發病死亡鴿，取其氣管、肺、泄殖腔等組織進行病毒分離。

1.8 分離毒株毒力的測定

《采用國際獸醫局的標準診斷方法和疫苗標準手冊》進行毒力檢測，將分離毒株經雞胚復壯一代的尿囊液進行試驗。1日齡雛雞腦內接種致病指數的測定，10日齡雞胚平均致死時間。

2 結果與分析

2.1 病料初步檢測結果

由圖1可知，2-4號樣品用H9AIV特異性引物進行檢測，3個樣品均出現480 bp大小的片段，而5-7號樣品為NDV特異性引物進行檢測，均無254 bp大小的片段，說明鴿群感染的是H9亞型禽流感病毒。

2.2 病毒分離結果

經尿囊腔接種的SPF雞胚在72 h內全部死亡，可見死亡胚全身出血、尿囊膜上也有較多的出血點。測其尿囊液HA效價為6～8log2。將尿囊液傳至第3代，死亡胚尿囊液平均HA效價達到9～11log2。用分離毒與NDV、H9N2、H5N1、EDS76陽性血清做HI試驗，其血凝作用可被H9N2陽性血清抑制，而不能被NDV、H5N1和EDS76陽性血清抑制。

2.3 動物回歸試驗結果

經攻毒的20只肉鴿，36 h后陸續出現精神沉郁、食欲下降、拉水便、呼吸啰音等發病癥狀，71 h后開始死亡至第14天，共16只死亡。剖檢死亡鴿，發現喉頭充血、氣管環出血、肺臟肉變、腺胃乳頭及肌胃與腺胃交接處形成出血帶、胰腺有點狀出血點、十二指腸、泄殖腔黏膜有出血斑。取病死鴿氣管喉頭、肺、泄殖腔組織，進行病毒分離，均能分離到H9亞型禽流感病毒，基因序列比較有待進一步研究。將攻毒后存活的4只肉鴿血清進行血凝抑制試驗，其HI效價為27、27、28、28。

2.4 分離毒株毒力的測定

經毒力測定，雞胚半數致死量為107.5/0.2 mL，雞胚平均致死時間為54.3 h，1日齡雛雞腦內接種致病指數為1.8，6周齡小雞靜脈接種致病指數為2.0，可判定該分離株應為強毒株。

3 討論

禽流感不僅嚴重危害養禽業，而且給公共衛生造成巨大威脅。H9N2亞型AIV在我國（特別是南方地區）持續流行，且宿主范圍廣泛，包括雞、鴨、珍珠雞、鵪鶉等[4-7]。發病情況差別較大，有的出現急性死亡，有的無癥狀帶毒。但國內對于鴿子感染發病的報道很少，其病原的研究就更少了。

通過對發病鴿群臨床癥狀的觀察，顯示本次發病鴿群疑似新城疫或禽流感病毒感染，因為其發病死亡率相對較低，不太像高致病性禽流感病毒的感染。新城疫和H9亞型禽流感感染在臨床上很難區分。本次調查首先通過分子生物學初步診斷，排除了新城疫病毒感染的可能性，判斷為H9亞型禽流感病毒感染。進一步進行其血凝、血凝抑制試驗檢測及毒力測定，確定為毒力較高的H9亞型禽流感病毒感染。病毒進化分析表明，我國禽群中主要流行Y280-like和G1-like兩個分支的H9N2亞型AIV。其中在我國雞群中主要流行 Y280-like 分支病毒， 而G1-like分支病毒僅在鵪鶉等珍禽中流行。另外，Y439-like和Ty/66-like分支病毒在我國也偶爾被分離到，但沒有形成流行[8，9]。本次分離到的H9亞型AIV到底是從哪里傳播來的？屬于哪個進化分支？還有待于進一步進行遺傳進化分析。

參考文獻：

[1] 甘孟侯.禽流感[M].北京：北京農業大學出版社，1995.

[2] SUN Y， TAN Y， WEI K， et al. Amino acid 316 of hemagglutinin and the neuraminidase stalk length influence virulence of H9N2 influenza virus in chickensand mice[J]. Journal of Virology， 2013， 87（5）： 2963-2968.

[3] 陳伯倫，張澤紀.禽流感研究：I.雞A型禽流感病毒的分離與血清學初步鑒定[J].中國獸醫雜志，1994，20（10）：3-5.

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