岡雜棉 8號SSR數(shù)字指紋圖譜的構(gòu)建

摘要：利用32對SSR引物對岡雜棉8號及其親本進(jìn)行多態(tài)性檢測，共有13對引物在2個親本間具有多態(tài)性，這些引物在兩親本間擴(kuò)增出大小不同的帶，且這些標(biāo)記位點在F1中均表現(xiàn)為雜合帶，為共顯性標(biāo)記。將這13對引物在親本和雜交種間擴(kuò)增檢測得到的01帶型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成十進(jìn)制數(shù)據(jù)，構(gòu)建了岡雜棉8號及其親本的數(shù)字指紋圖譜，為雜交種的真?zhèn)舞b定和純度檢測提供了方法。采用多對引物構(gòu)建的雜交棉數(shù)字指紋圖譜，能為岡雜棉8號的真?zhèn)舞b定、純度檢測及親本提純等工作提供更加準(zhǔn)確的技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：岡雜棉8號；SSR；數(shù)字指紋圖譜

中圖分類號：S562∶Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2057-04

棉花是常異花授粉作物，在良種繁育過程中常常出現(xiàn)品種退化現(xiàn)象，在人工制種過程中，因母本去雄不徹底或漏去雄而形成的自交鈴會嚴(yán)重影響雜交種純度，種子的混雜不僅影響產(chǎn)量，也會導(dǎo)致品質(zhì)的不一致，因此高純度的雜交種是棉花獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的基本保障[1]。快速、準(zhǔn)確而高效的純度鑒定對雜交棉品種的推廣應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。常規(guī)的純度鑒定多是利用形態(tài)性狀或（和）生理生化性狀等，受環(huán)境影響大，并且鑒定周期長[2]。DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接檢測基因組DNA之間的多態(tài)性，不受栽培條件、生態(tài)環(huán)境和生長發(fā)育階段等因素的影響，并且可以在全生育期的任何階段進(jìn)行檢測，包括種子也可以進(jìn)行檢測。SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記具有數(shù)量豐富，分布于整個基因組，等位變異高，多數(shù)共顯性遺傳，重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，在遺傳作圖、QTL定位、遺傳多樣性、關(guān)聯(lián)作圖及品種鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用[3]。分子指紋圖譜的研究工作在水稻[4]、玉米[5]、小麥[6]等多個作物上得到應(yīng)用。

在棉花上，經(jīng)前人鑒定，在眾多的SSR引物中選擇了多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特性好的引物作為棉花品種資源鑒定和分子指紋分析的核心引物[7，8]。殷劍美等[9]篩選了217對SSR引物，共有12對引物在兩個親本間具有多態(tài)性，構(gòu)建雜交棉蘇雜118的SSR指紋圖譜，為該品種的真?zhèn)舞b定和純度檢測提供了分子學(xué)依據(jù)。潘兆娥等[10]利用25對核心引物對中棉所48及其親本進(jìn)行多態(tài)性檢測，有14對引物在兩親本間擴(kuò)增出大小不同的帶，且這些標(biāo)記位點在F1中均表現(xiàn)為雜合帶，為共顯性標(biāo)記；構(gòu)建了中棉所48的數(shù)字指紋圖譜，為雜交種的真?zhèn)舞b定和純度檢測提供了方法。

岡雜棉8號是湖北省黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心鄂東南綜合試驗站用岡173-6為母本、岡19-28為父本配組選育而成，2008年3月通過湖北省農(nóng)作物品種審定委員會審定（審定編號鄂審棉2008005），因豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性好，深受廣大棉農(nóng)的喜愛[11-13]。為建立岡雜棉8號快速鑒定技術(shù)，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，根據(jù)已篩選和鑒定出的核心引物，構(gòu)建了岡雜棉8號及其親本的DNA指紋圖譜，為該品種的權(quán)益保護(hù)、真?zhèn)舞b別、雜種純度鑒定和親本提純等提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

雜交棉品種岡雜棉8號、母本岡173-6、父本岡19-28及用于純度鑒定的雜交種F1均由湖北盛豐科技有限公司提供。

1.2 引物序列信息

根據(jù)岡雜棉8號親本來源，參考前人在構(gòu)建棉花指紋圖譜及品種鑒定上使用的核心引物，選擇了32對SSR核心引物用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建[7]，SSR引物序列來源于Cotton CMD數(shù)據(jù)庫[14]，引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，引物具體信息見表1。

1.3 棉花基因組DNA的提取

田間取棉花幼嫩葉片，采用CTAB法提取所有試驗材料的總DNA，棉花葉片基因組總DNA的分離和純化參考Paterson等[15]的方法，提取的DNA用TE（Tris-EDTA ddH2O）溶解，利用賽默飛公司Thermo Scientific NanoDrop 2000超微量分光光度計對DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量測定及濃度定量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR反應(yīng)體系

將樣品DNA溶液用滅菌雙蒸水稀釋至10 ng/μL。PCR應(yīng)體系為：模板3 μL，正向引物（2U/mol） 2.5 ？滋L，反向引物（2 U/mol）2.5 ？滋L，dNTPs（10 mol/L）0.5 ？滋L，10×Buffer 2.5 ？滋L ，Taq酶0.5 U，補(bǔ)充ddH2O至25 ？滋L。擴(kuò)增儀器型號為Bio-Rad Mycycler，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，56℃退火45 s ，72 ℃延伸1 min， 34次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.5 PCR 產(chǎn)物的檢測

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠檢測。電泳槽為北京市六一儀器廠DYCZ-30型電泳槽，在15W恒功率電泳180 min左右，緩沖液為1×TBE，點樣量為每孔3.5 μL。電泳后的銀染法步驟：固定56 min；滲透12 min左右；ddH2O洗30 s；加入顯色液，輕搖至DNA條帶顯出為止；ddH2O洗 1～2 次；加入終止液終止反應(yīng)；統(tǒng)計帶型并照相。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與SSR分析

標(biāo)記的數(shù)據(jù)記錄根據(jù)電泳結(jié)果采用0、1系統(tǒng)描述條帶的相對位置，條帶清晰的記為1，缺失的則記為0，依據(jù)分子質(zhì)量從小到大的順序讀帶，不具多態(tài)性的條帶不予統(tǒng)計。然后，將每對引物在品種間擴(kuò)增得到的01（二進(jìn)制）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成十進(jìn)制數(shù)據(jù)，以位數(shù)最多的十進(jìn)制數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，位數(shù)不夠的在數(shù)字前面加0補(bǔ)成相同的數(shù)字位數(shù)，用該十進(jìn)制數(shù)代表每個引物的擴(kuò)增結(jié)果，用多個引物的十進(jìn)制數(shù)據(jù)組合成數(shù)字串作為該材料的數(shù)字指紋。

2 結(jié)果與分析

2.1 岡雜棉8號父母本的多態(tài)性檢測

利用32對核心引物對岡雜棉8號及其親本等3個材料進(jìn)行分子多態(tài)性檢測，其中有13對引物在兩親本間擴(kuò)增出不同帶型，說明這些引物在兩個親本間具有多態(tài)性。這13對引物分別為NAU1102、MUCS101、HAU1300、MGHES-44、NAU934、MON_CGR6410、Gh277、NAU1200、NAU1362、MON_SHIN-0376、NAU859、HAU2026、NAU1233，由親本間帶型可知這13對引物的標(biāo)記位點在F1中均表現(xiàn)為雜合帶型（圖1，以引物MUCS101為例），為共顯性標(biāo)記，這些標(biāo)記位點可清楚地區(qū)分父本母本及F1，因此可以直接用于岡雜棉8號雜交種的純度鑒定。

2.2 雜交種及其親本SSR數(shù)字指紋圖譜的構(gòu)建

利用13對共顯性引物對岡雜棉8號及其親本材料進(jìn)行基因型分析，獲得的條帶數(shù)據(jù)為01帶型記錄，隨后將二進(jìn)制（01）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為十進(jìn)制數(shù)據(jù)（表2）。如NAU1102在母本中的讀帶結(jié)果為011，將此二進(jìn)制數(shù)轉(zhuǎn)換為十進(jìn)制數(shù)為3，在父本中的讀帶結(jié)果為101，將此二進(jìn)制數(shù)轉(zhuǎn)換為十進(jìn)制數(shù)為5。用這13對引物組成的十進(jìn)制數(shù)字串分別代表親本及其雜種的數(shù)字指紋代碼，這些數(shù)字代碼分別對應(yīng)于相應(yīng)的SSR引物編碼，可以作為岡雜棉8號及其親本的分子身份證，為真?zhèn)坞s交種的辨別及親本的提純復(fù)壯等工作提供指導(dǎo)。

2.3 雜交種純度鑒定

通過多態(tài)性檢驗，獲得了13對共顯性標(biāo)記，理論上其中任何一對都可用于岡雜棉8號雜交種的純度鑒定。對制種基地某農(nóng)戶提供的樣品進(jìn)行隨機(jī)抽樣，抽取樣品種子100粒，采用引物MUCS101對樣本和親本進(jìn)行了純度鑒定，從擴(kuò)增的帶型來看，100粒種子中與父本帶型相同的有5株，1株帶型與母本相同，其余的與F1帶型相同，根據(jù)該引物檢測結(jié)果，在樣品中F1帶型的檢出率為94%。

3 結(jié)論與討論

雜種優(yōu)勢利用是棉花育種的有效手段之一，近年來轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉在生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用[16]。隨著產(chǎn)量水平的提高，育種單位的增多，生產(chǎn)上應(yīng)用的雜交種也不斷增多，但是由于棉花遺傳基礎(chǔ)狹窄，雜交種種間同質(zhì)性程度高，種間差異越來越小，并且形態(tài)差異多數(shù)受環(huán)境影響，品種的純度檢測和真實性鑒定都遇到了難題[17]。

SSR標(biāo)記是目前廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，一般呈共顯性遺傳，具有重復(fù)性好，多態(tài)性豐富等特點，用于棉花雜交種純度鑒定具有很大的優(yōu)越性。

目前棉花雜交種的制種一般都是采取人工去雄的方法，人工去雄技術(shù)是否規(guī)范直接影響雜交種種子的純度，制種過程中漏去雄、去雄不徹底或母本花藥粘著苞葉使柱頭造成串粉等情況常常導(dǎo)致母本自交成鈴，同時父母本混雜種植制種，在收獲過程中也可能引起父本混雜[18]。雜交種的純度不僅關(guān)系到經(jīng)營企業(yè)的聲譽和利益，還關(guān)系到棉花產(chǎn)量，影響棉農(nóng)收益。

由于棉種間形態(tài)差異較小，田間鑒定準(zhǔn)確度較差，一般僅能根據(jù)抗蟲基因的后代分離進(jìn)行鑒定[19]，因此構(gòu)建分子指紋圖譜技術(shù)將簡化鑒定流程，縮短鑒定時間，有利于及時快速了解種子的純度及真實性情況。

本研究利用32對核心引物對岡雜棉8號及其親本進(jìn)行多態(tài)性檢測，共有13對引物在2個親本間具有多態(tài)性，這些引物在兩親本間擴(kuò)增出大小不同的帶，且這些標(biāo)記位點在F1中均表現(xiàn)為雜合帶，為共顯性標(biāo)記。將這13對引物在不同材料間擴(kuò)增得到的01（二進(jìn)制）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成十進(jìn)制數(shù)據(jù)，構(gòu)建了岡雜棉8號的數(shù)字指紋圖譜，為雜交種的真?zhèn)舞b定和純度檢測提供參考。

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