畢節小檗的兩種同工酶分析

摘要：為探討畢節小檗（Berberis guizhouensis）2個居群的遺傳變異性和相似性，用聚丙酰胺垂直板凝膠電泳技術對畢節小檗2個居群的細胞色素氧化酶（COD）同工酶和過氧化物酶（POD）同工酶進行研究。結果表明，畢節小檗2個居群20株植株POD同工酶酶帶數為8條，其中有4條共同酶帶（POD-3、POD-5、POD-7、POD-8）；COD同工酶酶帶數為7條，其中也有4條共同酶帶（COD-3、COD-5、COD-6、COD-7）。不同居群的同工酶酶譜存在差異，同一居群的不同同工酶酶譜也存在差異；韭菜坪居群的分化程度大于艾家坪居群。

關鍵詞：畢節小檗（Berberis guizhouensis）；細胞色素氧化酶；過氧化物酶； 同工酶分析

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2264-03

小檗屬（Berberis L.）植物全世界約有500種，主產北溫帶，中國有250多種，主要分布于西部及西南部[1]。貴州省有26種1個變種[2]，據初步調查，六盤水有24種1個變種[3]。其中，畢節小檗（Berberis guizhouensis）為貴州省特有小檗屬藥用植物[4]。小檗屬植物俗稱三顆針，主要含尖刺堿（Oxyacanthine）、小檗胺（Berbamine）、小檗堿（Berberine）、藥根堿（Jatrorrhizine）、巴馬亭（Palmatine）等生物堿[5]，具有抗菌消炎、清熱解毒、降壓、利膽、抗心律失常和抗癌等作用[6]。許多種類可作黃連、黃柏的代用品。

李紅寧等[7]對金花小檗（Berberis wilsonae）、威寧小檗（Berberis weiningensis）及永思小檗（Berberis tsienii）的過氧化物酶（POD）同工酶進行了研究，關于畢節小檗同工酶的研究鮮見報道。同工酶作為基因表達的產物，是生物發生遺傳分化的證據，在進化中具有一定的保守性，不僅可以用來揭示生物居群遺傳學結構，了解種內、種間及種以上遺傳多樣性的情況，而且還可以用來判斷其繁育系統的性質及生殖方式[8]。POD、細胞色素氧化酶（COD）同工酶屬于氧化還原酶類，在植物中普遍存在，是生物的遺傳標記，它的酶譜在一定條件下較穩定，對于品種鑒定，親緣關系推斷等具有一定的價值[9]。

本試驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對畢節小檗兩個居群的過氧化物酶、細胞色素氧化酶同工酶進行了比較研究，探討其居群間的遺傳結構及多樣性，旨在為小檗屬植物的合理開發利用等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

畢節小檗于2011年11月在貴州省西部的威寧縣艾家坪和六盤水鐘山區韭菜坪采集，其中艾家坪居群隨機采集了12株植物（海拔2 250～2 300 m），韭菜坪居群隨機采集了8株植物（海拔2 300～ 2 400 m）。憑證標本存放于六盤水師范學院生命科學系植物標本室。

1.2 方法

樣品制備按照李紅寧等[7]的方法，電泳按照孫愛群等[10]的方法。

過氧化物酶同工酶染色參照胡能書等[11]的聯苯胺法：取聯苯胺0.1 g，加入無水乙醇5 mL、1.5 mol/L乙酸鈉10 mL、1.5 mol/L乙酸10 mL、蒸餾水75 mL、H2O2原液6滴，混合即為染色液。將電泳凝膠放入染色液中，置于37 ℃恒溫培養箱中保溫30～60 min即可。細胞色素氧化酶同工酶染液配方[12]為1%二甲基對苯二胺∶1% α-萘酚（溶于40%乙醇）∶0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4） =1∶1∶25（體積比）。

染色后對酶帶進行測量、記錄和拍照，并計算其相對遷移率（Rf），Rf=酶帶遷移距離（cm）/溴酚藍遷移距離（cm）。以同工酶縮寫名稱的大寫字母代表酶蛋白，以1、2、3表示向陽極遷移的位點，越靠近陽極的位點以越小的數字表示，如POD-1、POD-2等。

相似度指數=2個類群植物相同酶帶數/（2個類群植物相同酶帶數+2個類群植物不同酶帶數）[13]。依據數量分類中二態特征的0/1編碼原則[14]對每個個體的每條酶帶賦值，首先將各樣本看成一類，有酶帶計為1，無酶帶計為0，應用DPS v7.55軟件中的Jaccard系數，用類平均法（UPGMA）對樣品進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 畢節小檗POD同工酶酶譜分析

經過分析，畢節小檗2個居群20株植株POD同工酶譜共有8條酶帶（圖1），其中有4條為共同酶帶（POD-3、POD-5、POD-7、POD-8）。艾家坪居群酶帶數為3～7條，韭菜坪居群酶帶數為2～6條。韭菜坪居群的第3株植株無POD-8酶帶。共同酶帶在兩居群中的表現特征為POD-3、POD-5韭菜坪居群表達較強，艾家坪居群表達強弱不等； POD-7、POD-8 2個居群大部分植株表達較強。

2.2 畢節小檗COD同工酶酶譜分析

畢節小檗2個居群20株植株COD同工酶譜共有7條酶帶（圖2），其中有4條共同酶帶（COD-3、COD-5、COD-6、COD-7）。艾家坪居群酶帶數為4～6條，韭菜坪居群酶帶數為3～5條。艾家坪居群A-2、A-3、A-8、A-11植株及韭菜坪居群B-16、B-17、B-18、B-19植株均具有COD-2酶帶；艾家坪居群A-11植株還具有COD-1酶帶。此外，韭菜坪居群B-17植株無COD-3、COD-5酶帶，具有特有酶帶COD-4。共同酶帶COD-3、COD-5、COD-6、COD-7在2個居群中的表現特征為COD-3、COD-5表達活性較強，COD-6、COD-7表達活性稍弱。

2.3 POD與COD同工酶的聚類分析

采用DPS v7.55軟件對畢節小檗POD與COD同工酶進行聚類分析，結果如圖3所示。畢節小檗POD同工酶聚類分析表明，供試的20株植株可以聚為2個類群，一個為艾家坪居群的1-10號植株，另一個為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第11、12號植株；COD同工酶聚類分析表明，供試的20株植株也可以聚為2個類群，一個為艾家坪居群的1-11號植株，另一個為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第12號植株，說明同工酶水平可以將畢節小檗2個居群區分開。

3 小結與討論

同工酶是基因表達的直接產物，很大程度上能反映植物種間及居群間的親緣關系，可用于居群間生物多樣性的探討[8]。本試驗結果表明，畢節小檗艾家坪居群不同植株的POD同工酶相似度指數為0.677，韭菜坪居群不同植株POD相似度指數為0.590；而艾家坪居群不同植株的COD同工酶相似度指數為0.880，韭菜坪居群不同植株COD同工酶相似度指數為0.728。艾家坪居群POD同工酶及COD同工酶相似度指數均大于韭菜坪居群，說明艾家坪居群植株個體間分化程度較小，韭菜坪居群植株個體間分化程度較大。

畢節小檗2個居群的POD同工酶共有8條酶帶，其中有4條共同酶帶；兩個居群的COD同工酶共有7條酶帶，其中也有4條共同的酶帶。兩個居群POD同工酶相似度指數為0.606，COD同工酶相似度指數為0.689。說明畢節小檗不但具有一定程度的遺傳穩定性，而且也蘊涵著豐富的遺傳多樣性。

畢節小檗POD同工酶聚類分析結果表明，供試的20株植株可以聚為2個類群，一個類群為艾家坪居群的1-10號植株，另一個為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第11、12號植株，兩個居群基本可以區分。COD同工酶聚類分析表明，供試植株也可以聚為2個類群，一個為艾家坪居群的1-11號植株，另一個為韭菜坪居群的8株植株與艾家坪居群的第12號植株，兩個居群也可以區分，說明艾家坪居群與韭菜坪居群間有一定程度的分化。

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