白三葉葉片對酸沉降及凍融脅迫的生理響應特征

摘要：酸沉降及變溫條件下，植物會對脅迫產生一定的生理響應。通過人工酸沉降，測定酸脅迫下白三葉在變溫條件下葉片可溶性蛋白、丙二醛（MDA）及抗氧化酶活性的變化規律。結果表明，酸沉降脅迫下，葉片MDA、過氧化物酶（POD）、超氧化物酶（SOD）升高，分別升高0.60%～18.82%、10.34%～24.47%、0.09%～18.11%，而可溶性蛋白含量降低2.85%～24.18%，過氧化氫酶（CAT）活力變化趨勢不明顯；在融凍脅迫下，葉片抗氧化酶、可溶性蛋白隨溫度下降先增高后降低，最大值出現在-5 ℃，MDA呈上升趨勢，pH組、CK組最大值均出現在-15 ℃，分別為4.04、3.97 μmol/L。在凍融脅迫下，POD隨溫度升高而上升，SOD和可溶性蛋白先升高后下降，CAT活力先下降后趨于平穩，MDA含量持續下降。白三葉通過快速激活抗氧化酶活力和積累丙二醛以抑制膜脂過氧化在酸沉降和凍融脅迫上的適應，是未來值得推廣的園林綠色植物。

關鍵詞：白三葉葉片；酸沉降；凍融脅迫；抗氧化酶；MDA

中圖分類號：Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2083-04

白三葉草（Trifolium repens）屬于豆科車軸草屬，是多年生草本植物。其適應性強，耐寒、耐熱、耐干旱，且分布范圍廣。它是一種優良的豆科牧草，被廣泛應用于園林綠化和草坪建植，也是一種重要的綠肥植物，在發展園林綠化及園林生態建設上起重要作用[1-3]。

酸雨是指pH小于5.6的雨、雪或其他方式形成的大氣降水[4]。近20年來，我國酸性氣體造成的大氣污染不斷加劇。繼北美、歐洲之后，中國已經成為世界第三大酸沉降區， 且酸雨區面積呈加速發展的趨勢[5]。特別是中國北方地區，冬季供暖，加重了酸雨的侵蝕，已經對中國經濟造成巨大損失[6，7]。同時，溫度是主要影響白三葉草坪生長的環境因子，隨著全球氣溫不正常變化導致的融凍型凍害，對園林景觀也造成一定的損害[8]。

逆境條件下，植物往往容易產生較多的丙二醛（MDA），能與蛋白結合形成交聯物，引起生物體大分子蛋白、核酸變化，從而改變細胞膜系統，因此通常用MDA評價植物質膜受損程度的指標；同時在脅迫條件下，植物會產生大量的活性氧合自由基，引起膜的過氧化和傷害，而過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）在清除活性氧自由基和防止膜脂過氧化維持膜完整性上起重要作用。為此，將通過酸沉降及凍融脅迫的方法，測量白三葉葉片可溶性蛋白、MDA、抗氧化酶（SOD、CAT、POD）在此過程中生理指標變化和凍融脅迫后恢復能力，以期了解白三葉對溫度、酸沉降適應的生態幅，可為未來作物抗凍及防治酸沉降對草坪草的危害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 白三葉 供試白三葉品種蘭迪（Landy），由吉林省農業科學院提供。于2014年4月初挑選飽滿粒大的種子，采用撒播方式，將種子播撒在吉林大學環境與資源學院室外試驗田中（N 43°83′35.3″，E 125°28′75.2″）。試驗田土壤有機質含量為32 g/kg，全氮1.012 g/kg，全磷0.428 g/kg，全鉀21.55 g/kg，土壤平均pH 6.9。取表層土壤將白三葉種子覆蓋，避免暴曬，播種初期定時人工澆水，待長出幼苗，減少澆水量及次數。盡量保證植物生長環境，如光照，濕度、溫度、土壤組分等相同。

1.1.2 模擬酸沉降溶液 根據長春市天然降水pH及離子水平，考慮到天然降水離子成分的復雜性，選擇自來水配制模擬酸沉降的原溶液，再用濃硫酸與濃硝酸（SO42-∶NO3-=5∶1）配制pH 4.5模擬酸沉降溶液[9]，進行模擬酸沉降淋澆，試驗以自來水作為對照組（CK）。模擬酸雨pH由pHS-3C型雷磁酸度計測定與校對。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸沉降試驗 將試驗田分為2組，分別為pH組、CK組，每組面積大小為10 m×3 m，每組之間有2 m緩沖區。試驗于2014年7月對pH組進行模擬酸沉降淋澆，周期為40-55 d，每8 d噴淋一次，噴淋時間為17：00～18：00，單次噴淋量相當于10 mm降雨量，選用塑料壓力噴壺作為人工模擬降雨器，將配制溶液均勻噴至pH組內，通過調節壺內壓力調節降雨強度，調節噴頭控制酸雨雨滴大小。

1.2.2 人工凍融試驗 于2014年9月，在試驗田中分別從pH組、CK組中隨機用撬鏟取長、寬、深均為0.25 m的白三葉樣品，各6份，標記好后將帶有土壤及根系的試驗材料從室外采樣，送回實驗室（15 ℃）過夜，第二天早晨開始融凍-凍融處理。融凍試驗處理為每2 h降溫5 ℃，一樣的凍融試驗為每2小時升溫5 ℃，試驗的溫度設計為5、0、-5、-10、-15、-10、-5、0、5 ℃，每2 h一變溫隨即取樣，每次分別從pH組、CK組隨機剪取葉片混勻后用錫箔紙包裹放入液氮中固定，將活性保存，隨后放于-80 ℃超低溫冰箱中，用于各項生理指標測定。

1.2.3 生理指標測定方法 硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛（MDA）含量[10]；考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量[10]；分別采用SOD、POD、CAT試劑盒測定其活性。每個指標做3組平行樣。

2 結果與分析

2.1 酸沉降及凍融脅迫對白三葉葉片可溶性蛋白含量的影響

試驗中，酸沉降脅迫處理下的葉片可溶性蛋白含量均比對照組低，降低了2.85%～24.18%，這可能是由于酸沉降使白三葉草體內的蛋白質合成酶活性降低或遭到破壞，導致生理代謝紊亂，然而蛋白質溶解酶活性增強，導致分解加快，說明酸沉降處理引起植物組織中可溶性蛋白質含量的降低，這與胡雁春[11]對白三葉耐酸性研究結果一致。

在融凍階段，溫度由5 ℃降低到-5 ℃時，酸雨組和對照組中葉片可溶性蛋白含量均增加并達到最高，分別為31.44 mg/g、36.79 mg/g，分別增加了23.05%、33.84%，當溫度持續下降到-15 ℃，可溶性蛋白質含量下降，達到pH組、CK組最小值，分別為19.43 mg/g、20.74 mg/g。在凍融階段，溫度回升至-5 ℃，葉片可溶性蛋白含量又增加達到第二個高峰，分別為29.33 mg/g、30.45 mg/g，在持續升溫過程中含量基本保持不變（圖1）。這與Fleck等[12]對冬小麥葉片穩定蛋白質積累與其抗凍性研究結果一致，說明抗凍性強的品種能更有效地刺激積累保護物質，低溫脅迫使根系細胞內可溶性蛋白含量增加，有效緩解細胞代謝抵抗低溫。Guy[13]也得出過類似的結論。

2.2 酸沉降及凍融脅迫對白三葉葉片丙二醛含量的影響

酸沉降脅迫處理下的丙二醛含量高于對照組， 增加了0.60%～18.82%。說明酸沉降處理引起植物葉片MDA含量的積累，MDA是膜脂過氧化的主要產物之一，MDA含量越高越不利于植物生長。這與吳杏春等[14]的試驗結果一致，在酸雨脅迫下，造成MDA的相對含量升高，加劇膜的損傷。

融凍-凍融脅迫中，酸沉降組與對照組中MDA活力變化趨勢相同。融凍階段，溫度從5 ℃降到 -15 ℃，白三葉結凍，葉片丙二醛含量呈上升趨勢，pH組、CK組最大值均出現在-15 ℃，分別為4.04 、3.97 μmol/L，相對5 ℃分別增加了31.08%、53.77%。在凍融階段，白三葉開始解凍，丙二醛含量持續下降，與最高值相比，pH組、CK組分別下降了36.97%、44.26%（圖2）。這說明低溫脅迫下細胞內活性氧代謝的平衡被破壞從而有利于活性氧的產生，活性氧過剩的毒害之一是引發或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統的損傷，MDA含量多少代表膜損傷程度的大小，這與范玉貞[15]關于白三葉抗凍生理機理研究結果一致。

2.3 酸沉降及凍融脅迫對白三葉葉片CAT活力的影響

在酸沉降脅迫處理下的CAT活力與對照組變化趨勢不明顯，這可能與在較輕的酸沉降脅迫下，并沒有引起其抗性變化有關。CAT存在于過氧化物體內，可以清除自由基，使細胞膜避免損害，說明酸沉降處理并不會引起植物組織中CAT含量有大幅變化。

在融凍階段，隨溫度的降低，白三葉葉片CAT活力增高，-5 ℃時pH組、CK組CAT活力均達到最大值，分別為11.49、11.28 U/mg，相對于5 ℃分別升高了33.88%、26.31%，而當溫度繼續下降時，CAT活力明顯下降。在凍融階段，隨溫度的升高，CAT活力先下降后趨于平穩（圖3）。這與安瑩等[16]試驗結果一致。可見融凍過程中-5 ℃時，對白三葉是沒有傷害的，但隨著溫度繼續降低，CAT活力明顯下降，且在凍融升溫階段，未見活力上升，說明低溫產生大量H2O2，而過量的H2O2無法消除，致使CAT活力下降，引起膜脂過氧化對葉片產生傷害。

2.4 酸沉降及凍融脅迫對白三葉葉片POD活力的影響

本試驗中，酸沉降脅迫處理下POD活力比對照組高，增加了10.34%～24.47%，說明酸沉降處理引起植物組織中POD含量增加。POD是植物細胞的保護性酶，它的變化能在一定程度上反映品種的抗酸性大小，活性越高，變化越大，抗酸能力越強[11]。

白三葉葉片POD活力在融凍階段隨溫度下降而增高，在葉片完全凍結（-5 ℃）時，pH組、CK組達到最高分別為81.15、65.19 U/mg，升高了17.84%、12.88%。隨溫度繼續降低，POD活性也隨之下降，并在-15 ℃達到最小值分別為60.75、54.86 U/mg，下降了33.59%、18.84%。在凍融階段，隨溫度升高葉片解凍而活性上升，隨后趨于穩定（圖4）。Zhou等[17]和Guo等[18]對高寒山區的多年生牧草中抗氧化酶活力變化的研究與本試驗結果一致。

2.5 酸沉降及凍融脅迫對白三葉葉片SOD活力的影響

在酸沉降脅迫下，白三葉葉片SOD活性高于對照組，增加了0.09%～18.11%，說明在適度酸沉降脅迫下可激發植物自身抗逆體系，誘導SOD活性增大，減少活性氧對膜脂的過氧化作用，這與齊澤民等[19]研究結果一致，說明酸沉降脅迫提高了葉片SOD活性。

融凍-凍融脅迫試驗中，隨溫度下降，葉片SOD活力增高，在-5 ℃達到最高，pH組、CK組分別達到135.24、130.65 U/mg，增加37.36%、46.22%。當葉片完全結凍時（-15 ℃）SOD活力下降，pH組、CK組分別為110.37、110.48 U/mg。凍融階段，當溫度回升至-5 ℃時，pH組SOD活力再次上升，為119.02 U/mg。隨著升溫，白三葉解凍，SOD活力又降低，但值仍較高（圖5）。在融凍和凍融階段，SOD活性均在-5 ℃達到最高值，這說明白三葉葉片SOD在-5 ℃時反應比較敏感。這說明逆境脅迫會促進活性氧產生，損傷膜系統，植物體內SOD活性的升高現已被普遍認為是植物抵抗低溫逆境的一種生理反應[16]。這與張圣平等[20]在低溫脅迫對野生黃瓜嫁接苗的研究結果一致。

3 結論

在酸沉降及變溫脅迫下，白三葉葉片中丙二醛含量增加，加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統的損傷，白三葉通過快速激活過氧化物酶、過氧化氫酶及超氧化物酶的活力，來防御離子自由基對細胞的傷害，從而保護白三葉對脅迫的適應，使白三葉仍可以繼續生長。結果表明白三葉對未來氣候引起的凍融型及酸沉降型傷害有很強的適應性，具有草坪綠化價值，是值得推廣的優良園林植物。

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