5—氮雜—2'—脫氧胞嘧啶核苷對腫瘤細胞化療敏感性的作用研究

目前，許多腫瘤常規化療效果差，預后不良是困擾臨床的重要難題，而腫瘤多藥耐藥性（MDR）則是腫瘤化療失敗的關鍵因素。經治療后，殘存的腫瘤干細胞耐藥性形成，常導致對某些藥物治療敏感性降低，并引起腫瘤復發甚至轉移，因此MDR已成為當今醫學界研究的熱點[1]。

國內外均有大量文獻表明5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷能增強化療藥物對腫瘤細胞的作用，即降低腫瘤細胞的耐藥性[2]。雖然早期應用于血液病，但在實體腫瘤中也有不同的作用機制來增強傳統化療藥物的敏感性，為臨床上對抗腫瘤多藥耐藥提供了新的思路。

1 5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷（地西他濱）的發展歷史

5-氮雜胞苷、5-氮雜-2'脫氧胞苷（地西他濱）最廣泛的應用于DNA的去甲基化。在體內外，脫甲基作用導致遺傳學上沉默的腫瘤抑制因子慣序地激活。盡管地西他濱作有抗白血病的作用被發現已有40年歷史，它在惡性血液病的治療潛力僅僅最近才被批準用于高風險的骨髓增生異常綜合征以及作為年齡>65歲、非加強化療的急性髓性白血病患者的一線用藥。一些臨床試驗顯示小劑量地西他濱在治療慢性粒細胞白血病和血紅蛋白病也有潛力，然而對實體腫瘤的療效有限。臨床反應似乎在表觀遺傳學、細胞周期阻滯和/或細胞凋亡都有表現。最近的和進行中的臨床試驗探討新的給藥方案、給藥途徑以及地西他濱與其他藥物的配伍，這些藥物包括組蛋白脫乙酰酶抑制劑[3]。

2 5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷（地西他濱）作用機制

5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-cdR）即地西他濱（decitabine）是一種天然的脫氧胞苷酸的腺苷類似物。在細胞內，經磷酸化后與腫瘤內的胞嘧啶競爭，以共價鍵與DNA甲基化轉移酶結合，使DNA甲基化轉移酶失活，阻斷細胞周期，抑制細胞增殖，從而發揮抗腫瘤的作用。臨床研究發現小劑量的地西他濱對腫瘤的治療有效，相對的實驗室研究認為小地西他濱使DNA甲基化轉移酶失活，誘導腫瘤細胞向正常細胞分化[4]。

目前腫瘤的耐藥性是臨床上的難題，也是腫瘤患者預后不良的一個重要因素[5]。在遺傳學上，存在基因改變。而在表觀遺傳學上，DNA序列沒有改變，只是基因被甲基化修飾，抑制基因的表達[6]。在哺乳動物基因組中，胞嘧啶含量僅為1%。這是因為胞嘧啶容易被甲基化成為5-甲基胞嘧啶。當癌基因低甲基化、抑癌基因高甲基化時，癌基因過度表達，導致腫瘤的發生[7]。已有大量文獻表明5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷能增強化療藥物對腫瘤細胞的作用，即降低腫瘤細胞的耐藥性，現大致綜述如下。

2.1肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。目前沒有有效地藥物干預能治療肝癌[8]。大多數惡性腫瘤表現出異常基因啟動子區域的甲基化導致基因功能的喪失[9]。去甲基化試劑5-Aza-CdR可以重新激活MAT1A基因表達和抑制MAT2A基因表達，誘導人肝癌細胞生成相同的產物，扭轉MAT1A啟動子的甲基化，從而它抑制肝癌細胞的生長。研究結果可以提供一個機制，通過5-Aza-CdR對肝癌細胞發揮持續增長的抑制作用[10]。在肝癌細胞中，丟失了表觀遺傳學修飾的癌細胞對放化療缺乏應答。甲硫氨酸腺苷轉移酶1A在肝癌細胞中是滅活的，它的滅活可能是基因的表觀遺傳學改變，這些改變中包括啟動子甲基化。因此，藥物解放表觀遺傳學的抑制作用可能逆轉這個過程[11]。Liu，W.J研究了去甲基化試劑5-氮雜-2'脫氧胞苷在肝癌細胞Huh7細胞系中對MAT1A基因表達、DNA甲基化和腺苷甲硫氨酸產生的影響。我們發現在經5-氮雜-2'脫氧胞苷干預的肝癌細胞Huh7細胞系中，MAT1A mRNA和蛋白的表達激活，啟動子甲基化也逆轉了。同時也發現經5-氮雜-2'脫氧胞苷處理后的肝癌細胞Huh7細胞系中，MAT2A mRNA和蛋白的表達顯著減少，腺苷甲硫氨酸產物也顯著減少。然而，5-氮雜-2'脫氧胞苷對MAT2A甲基化沒有作用。此外，5-氮雜-2'脫氧胞苷通過下調Bcl-2、上調Bax、caspase-3來抑制肝癌Huh7細胞系的增殖、誘導凋亡。我們的觀察值顯示5-氮雜-2'脫氧胞苷在肝癌Huh7細胞系中通過改變基因的表觀遺傳增加甲硫氨酸腺苷轉移酶1A的表達以及誘導活性腺苷甲硫氨酸的產生發揮了抗腫瘤作用[12]。

2.2有前期的實驗室和臨床數據顯示使DNA去甲基化的藥物有潛在地減少鉑抵抗型卵巢癌的發展[13]。為此，Glasspool，R.M測試了DNA低甲基化試劑5-氮雜-2'脫氧胞苷（地西他濱）可逆轉卡鉑抵抗的復發性卵巢癌的女患者這個假說。在卵巢癌中，mir-130b基因表達水平的下調與臨床分期達到III-IV期和組織學分化較差的腫瘤有關。mir-130b的表達能夠抑制多藥耐藥卵巢癌細胞。恢復mir-130b的表達可以使抗癌藥物敏感性增強。目前的研究發現mir-130b基因甲基化水平與卵巢癌組織以及耐藥細胞系負相關的表達式。脫甲基的5-aza-CdR導致激活mir-130b在耐藥卵巢癌細胞株的表達，從而增加順鉑和紫杉醇的感性。在這個化療計劃中，在部分鉑抵制的卵巢癌患者添加地西他濱是降低還是增加卡鉑化療的有效性很難區分。在未來的聯合用藥研究中，患者的選擇，不同的化療方案或者不同的去甲基化試劑都需要考慮進來[14]。

2.3橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤是兒童最常見的肉瘤[15]。盡管使用標準的療法，將近有1/3的尤因氏肉瘤的患者復發，并且復發后有治療潛力的藥物極其有限。免疫療法是一種有潛力的治療方法[16]。它以腫瘤特異抗原為靶，保留正常細胞。已經有文獻[17]證實去甲基化試劑5-氮雜-2'脫氧胞苷（地西他濱）可以上調睪丸癌抗原、人類主要組織相容性復合體分子、細胞內細胞粘附分子-1在兒童肉瘤細胞系中的表達，結果加強了兒科骨肉瘤患者睪丸癌抗原特異的細胞毒性T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的作用。按藥理學劑量水平的地西他濱處理骨肉瘤細胞系后，在mRNA水平也有重要的表達增加，MAGE-A1和MAGE-A3達到70%，NY-ESO-1達到80%。在停止地西他濱干預>30 d后，在肉瘤細胞系和原發腫瘤細胞系MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1依然維持高表達。此外，在用地西他濱研究過的9個細胞系中，有7個誘導上調MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1蛋白的表達。這些研究表明在治療兒科骨肉瘤時，可聯合使用去甲基化試劑和睪丸癌抗原誘導的免疫療法[18]。

2.4對于進展期的前列腺癌去雄激素治療是最基本的治療方案。然而，通過最初的回歸分析，大多數患者不可避免的發展成致命的非雄激素依賴型腫瘤[19]。因此，弄清楚非雄激素依賴型前列腺癌的轉變機制對治療不能進行傳統化療的老患者確定新的治療方案是很要緊的。[20]Wang-X驗證了在LNCaP和PC3了兩種細胞系中，5-氮雜-2'脫氧胞苷誘導細胞凋亡并增加miR-146a的表達。miR-146a的表達在LNCaP細胞系比PC3細胞系中更高。在5-氮雜-2'脫氧胞苷處理的細胞中MiR-146a抑制劑抑制了細胞凋亡。在移植了LNCaP細胞系的閹割鼠模型中，5-氮雜-2'脫氧胞苷顯著地抑制了腫瘤生長，也抑制了前列腺癌的進展。同時，在經過5-氮雜-2'脫氧胞苷處理的移植鼠皮下的雄激素依賴型腫瘤中，MiR-146a表達也顯著地增強，而在非雄激素依賴的閹割鼠移植腫瘤的各各階段中卻不是這樣。尤其在用5-氮雜-2'脫氧胞苷和雄激素聯合處理的各各階段中，MiR-146a的表達顯著擴增。此外，在miR-146a啟動子結合部位的兩個CpG位點（-444bp和-433bp）的去甲基化百分比顯示在聯合處理腫瘤的各各階段CpG位點去甲基化水平最低。通過5-氮雜-2'脫氧胞苷處理低甲基化的miR-146a啟動子上調miR-146a的表達，與延緩雄激素抵抗的前列腺癌有關。此外，在雄激素依賴的前列腺癌進展成非雄激素依賴的前列腺癌中，位點專一的DNA甲基化對miR-146a的表達有重要作用。因此為評價前列腺癌的藥效提供了潛在的有用的生物學標記物[21]。

2.5膀胱癌是高復發的腫瘤，需要行特殊的經尿道切除術和膀胱內灌注化療[22]。目前臨床上發現膀胱腫瘤對傳統化療藥物存在多藥耐藥性，這也就促使我們更加努力地尋找新的治療藥物和早期診斷工具[23]。蛋白表達的特殊改變可以提供診斷膀胱腫瘤標志物。在人膀胱癌細胞，5-氮雜-2'脫氧胞苷增加了GSTM1 mRNA和蛋白的表達。這些數據表明在泌尿上皮腫瘤中GSTM1的下調是膀胱腫瘤發生的標志物，并且這可以被基因的去甲基化所調 節[24]。目前也有相關文獻報道，5-氮雜-2'脫氧胞苷對膀胱腫瘤T24細胞生物學行為有影響，腫瘤細胞凋亡增加。膀胱腫瘤中XIFI基因表達水平上調，XIAP基因無明顯改變，XAF-1蛋白表達上調、NF-KBP65蛋白上調，并且與5-氮雜-2'脫氧胞苷有明顯的劑量效應關系[25]。

3結論

腫瘤的發生、發展是多基因作用的結果，當然這些作用機制在各個腫瘤中不是唯一的，其他指標也有改變，有待我們進一步研究。同時為我們在臨床上遇到腫瘤耐藥情況提供了新的聯合用藥思路。

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