HPLC法測定芪葛顆粒中葛根素的含量

摘要：目的 建立芪葛顆粒中葛根素含量測定方法。方法 采用高效液相色譜法，PhenomenexLuna5uC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-水（25：75），流速1.0ml·min-1，柱溫30℃，檢測波長為250nm。結果 葛根素在16.88～270.00μg/ml，呈良好的線性關系（r=0.9998），定量限為6.78ng·ml-1，回收率為96.5%，RSD為1.0%（n=9）。結論 本方法快速、準確、穩定、重復性良好，可作為芪葛顆粒質量分析控制方法。

關鍵詞：芪葛顆粒；葛根素；高效液相色譜

芪葛顆粒由黃芪、葛根、桂枝、威靈仙等8味中藥經提取精制而成，具有溫經活血，疏風散寒，宣痹通絡的功效，用于神經根型頸椎病風寒阻絡證引起的頸項強痛、肩背疼痛、頸項活動不利、肢體麻木、畏寒肢冷、四肢拘急等癥[1]。葛根為方中君藥，且用量最大，為加強本品內在質量控制，在原有黃芪甲苷含量測定的基礎上[1]，增加葛根中葛根素的含量測定，同時對方法中供試品制備的提取溶劑、提取方法、提取時間、提取溶劑用量均進行了考察，制定了本品中的葛根素含量測定方法。

1儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1200高效液相色譜儀，G1315DDAD二極管陣列檢測器，所用軟件為ChemStation色譜工作站。Milli-QAdvantageA10超純水機，SatoriusME5電子分析天平，KQ-250DV超聲波清洗儀，電熱恒溫水浴鍋。

1.2試藥 芪葛顆粒（江蘇康緣藥業股份有限公司，規格為10g/袋，批號120201、120301、120501、120601、120602、120901、121001、130101）；葛根素對照品，購自中國食品藥品檢定研究院（供含量測定用，批號為110752-200912）；甲醇（色譜純，美國天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2色譜條件

色譜柱：PhenomenexLuna5uC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（25：75）；流速：1.0ml·min-1；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；進樣量：5μl。理論板數按葛根素峰計算不低于4000，見圖1。

圖1 葛根素對照品（A）、芪葛顆粒樣品（B）及芪葛顆粒陰性樣品（C）HPLC色譜圖

3提取方法的考察

采用正交試驗法優化提取方法，考察提取溶劑A、提取時間B、提取方法C及溶劑用量D，4個因素對提取結果的影響。因素水平見表1。L9（34）正交表設計及結果見表2。

從極差R值可以看出，影響提取的因素：提取溶劑A>提取方法C>提取時間B>溶劑用量D；各因素的最有水平組合為A1C2B1D2。對上述結果進行方差分析見表3，從方差分析結果可以看出，影響因素提取溶劑A最具有顯著性，影響因素順序為：提取溶劑A>提取方法C>提取時間B>溶劑用量D；各因素最優水平組合為A1C2B1D2，與直觀分析結果一致。最終確定提取方案為：50ml的30%乙醇，回流提取30min。

4溶液的制備

4.1對照品溶液的制備 取葛根素對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成每1ml含80μg的溶液，即得。

4.2供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，研細，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

5線性關系考察

精密稱取葛根素對照品適量，制得一定濃度的標準品儲備液（濃度為270μg/ml）。將儲備液分別稀釋成濃度為16.88μg/ml、33.75μg/ml、67.50μg/ml、135.00μg/ml、270.00μg/ml的溶液，分別進樣5μl，以進樣質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程為Y=21.005X+6.7597，r=0.9998結果表明葛根素在16.88μg/ml～270.00μg/ml范圍內呈良好線性關系。按信噪比（S/N）為10：1計算，葛根素的定量限為6.78ng/ml。

6精密度試驗

精密吸取葛根素對照品溶液5μl，重復進樣6次，以峰面積計算RSD值為0.39%，結果表明該方法精密度良好。

7重復性試驗

取同一供試品（批號為120601），按4.2制備供試品溶液，平行制備6份，測定，結果葛根素的平均含量為91.2mg/袋，RSD=1.7%，結果表明該方法重復性良好。

8中間精密度試驗

取同一供試品（批號為120601），按4.2制備供試品溶液，由兩位分析人員于不同時間分別制備6份供試品并分別使用兩臺儀器測定，計算RSD值為1.9%，結果表明該方法中間精密度良好。

9穩定性試驗

取同一供試品（批號為120601），按4.2制備供試品溶液，分別在第0、1、2、4、6、8、12、16h進行測定，計算峰面積RSD為0.2%，結果表明供試品溶液在16h內穩定良好。

10回收率試驗

取已知含量的樣品（批號120601，葛根素含量：91.2mg/袋）九份，每份0.5g，分別按80%、100%和120%加入對照品，按4.2制備供試品溶液，分別精密吸取5？L，注入液相色譜儀，測定，計算加樣回收率，見表4。

11樣品測定

取7批樣品，按3.2制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算，見表5。

12討論

12.1色譜條件耐用性考察 本文對不同品牌色譜柱、不同柱溫和不同流動相比例進行了考察，結果表明本文采用的色譜條件耐用性良好。

12.2測定波長的選擇及色譜峰純度驗證 根據葛根素的全波長紫外吸收光譜及文獻[2～4]，選擇250nm做為葛根素測定波長，經試驗在此波長下，供試品色譜中葛根素峰與其它雜質峰達到很好的分離，陰性樣品無干擾。使用二極管陣列檢測器，對葛根素對照品色譜和供試品色譜中的葛根素吸收峰，分別讀取了190～370nm的紫外吸收光譜。經對二者的紫外吸收光譜進行比較，發現紫外吸收光譜相似度達到97%。

12.3芪葛顆粒質量標準中尚無對葛根素含量測定的方法，本實驗建立的方法操作簡單、快速，結果準確、可靠，可作為芪葛顆粒質量控制依據。

參考文獻：

[1]徐忠坤，徐海娟，宋娟，等.HPLC法測定芪葛顆粒中黃芪甲苷[J].中草藥，2011，42（1）：94～95.

[2]吳青業，周恩麗，付小環，等.HPLC-ELSD法測定芪葛口服液中黃芪甲苷[J].中草藥，2010，41（8）：1305～1306.

[3]李向陽，李振國.葛根芩連片中葛根素含量測定方法的驗證[J].中醫研究，2007，20（5）：29～30.

[4]梁軍，郭衛東，高睿.冠脈寧軟膠囊中葛根素含量測定[J].遼寧中醫雜志，2006，33（12）：1619.

編輯/申磊