Hcy對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞中microRNA—125b表達(dá)的影響

摘要：目的 探討同型半胱氨酸（Hcy）對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞中microRNA-125b表達(dá)的影響。方法 原代培養(yǎng)人臍靜脈平滑肌細(xì)胞，分為空白對(duì)照組，Hcy干預(yù)組（50、100、200、500 μM）共計(jì)5組；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活；熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)各組VSMCs中miR-125b的表達(dá)。結(jié)果 MTT法顯示Hcy 可以明顯促進(jìn)VSMCs增殖（P<0.05），qRT-PCR法顯示Hcy干預(yù)各組中miR-125b表達(dá)下調(diào)（P<0.01），但兩者都不是劑量依賴關(guān)系，且都在100 μM Hcy處作用最明顯。結(jié)論 Hcy 促進(jìn)VSMCs增殖可能是由于miR-125b的表達(dá)下調(diào)引起的。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；microRNA；血管平滑肌細(xì)胞；動(dòng)脈粥樣硬化

中圖分類號(hào)：R543.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）所致的心腦血管疾病是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一。血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的活化、增殖、浸潤(rùn)功能的改變是AS形成的中心環(huán)節(jié)。大量研究表明同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy）是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1]，而研究顯示Hcy可以明顯促進(jìn)VSMCs的增殖[2]。miR-125b是動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞主要表達(dá)的microRNA之一[3]。研究表明，miR-125b的表達(dá)在正常組織與AS病理組織中存在顯著差異，但是Hcy是否對(duì)miR-125b存在影響以及存在何種影響目前未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬培養(yǎng)原代血管平滑肌細(xì)胞，給予不同濃度的Hcy干預(yù)后，檢測(cè)其對(duì)VSMCs的增殖活性，并檢測(cè)miR-125b的表達(dá)，明確Hcy對(duì)miR-125b表達(dá)的影響，為進(jìn)一步揭示Hcy在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sino-America Biotech；同型半胱氨酸、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；miRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根；熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)液為含 10%胎牛血清 青霉素100 U/ml 鏈霉素100 g/ml 的 DMEM/F-12培養(yǎng)基， 置于37℃ 飽和濕度 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測(cè)VSMCs增殖活性 將VSMCs消化后，以每孔103～104的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔終體積為200 μl。繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，避光條件下每孔加入MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h后，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液。每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。利用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值，記錄并分析結(jié)果。

1.2.3熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b的表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總miRNA，之后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)miR-125b的表達(dá)；miR-125b引物序列：上游5'-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3'，下游5'-GCTGTCAACATACGCT ACGTA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物78 bp；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃ 變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 次循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，根據(jù)PCR儀自動(dòng)生成的Ct值，根據(jù)公式計(jì)算目的基因的相對(duì)量：相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以（x±s）表示。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用One-way ANOVA進(jìn)行多樣本均數(shù)間比較，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1 Hcy對(duì)VSMCs增殖的影響 MTT結(jié)果顯示不同濃度Hcy干預(yù)VSMCs后，Hcy可以明顯促進(jìn)VSMCs細(xì)胞的增殖活性，但并不呈劑量依賴關(guān)系，但并不是劑量依賴關(guān)系，在100 μM Hcy處作用最明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 Hcy對(duì)miR-125b的表達(dá)的影響 qRT-PCR法檢測(cè)各組VSMCs中miR-125b的表達(dá)，結(jié)果顯示，Hcy可以明顯抑制miR-125b的表達(dá)，但并不呈劑量依賴關(guān)系，在100 μM Hcy處作用最明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2。

3討論

microRNAs（miRNAs）在生物體基因調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因沉默效應(yīng)。miRNA雖然大約只占人類預(yù)測(cè)基因的3%以上，但卻調(diào)控大約30%的蛋白編碼基因，涉及細(xì)胞的增殖、分化等。不同組織和細(xì)胞具有特異性的miRNAs，比如miR-142和miR-223在造血系統(tǒng)特異性表達(dá)，miR-1、miR-30c和miR-26等在心肌細(xì)胞中特異表達(dá)[4]；而動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞主要表達(dá)的miRNA為miR-125b 、miR-145及miR-143 等[3]。miR-125b不僅在正常組織不同部位表達(dá)不同，在正常組織與病理組織中miRNAs的表達(dá)也存在明顯差異，Tatsuguchi M等首次在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型中發(fā)現(xiàn)miR-125b等表達(dá)下調(diào)[5]；Ruirui Ji等利用基因芯片的技術(shù)檢測(cè)了頸動(dòng)脈泡沫樣損傷大鼠模型頸動(dòng)脈中microRNA的差異表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)miR-125b的含量下調(diào)[6]，這些都提示miR-125b通過(guò)參與VSMCs的生物學(xué)進(jìn)程影響了AS的發(fā)生發(fā)展。而本課題研究發(fā)現(xiàn)，在Hcy干預(yù)下的VSMCs中，miR-125b低表達(dá)，提示Hcy通過(guò)影響Hcy的表達(dá)參與了VSMCs的增殖過(guò)程。此過(guò)程并不是劑量依賴關(guān)系，對(duì)此，我們分析可能的原因是：過(guò)高濃度的Hcy導(dǎo)致了其他的反應(yīng)，如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，這些反應(yīng)導(dǎo)致了VSMCs的損傷而失去其正常狀態(tài)；或者是Hcy導(dǎo)致的這些反應(yīng)因?yàn)镠cy濃度的過(guò)高而超出了VSMCs自我修復(fù)的范圍，打破了損傷與修復(fù)的平衡，從而導(dǎo)致了以上結(jié)果的發(fā)生，也提示有更生層次的機(jī)制存在。

綜上所述，本課題首次發(fā)現(xiàn)在Hcy導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，其可能是通過(guò)影響miR-125b的表達(dá)促進(jìn)了VSMCs增殖。

參考文獻(xiàn)：

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[6]Ruirui Ji， Cheng Y， Yue J， et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of microRNA in vascular neointimal lesion formation[J].Circ Res，2007，100：1579-1588.

編輯/肖慧