膿毒癥患者調節性T細胞的檢測及意義

王晗旭，胡文全，韓琨，李莉

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論著·臨床

王晗旭，胡文全，韓琨，李莉

目的 探討膿毒癥患者外周血CD+4CD+25CD127low調節性T細胞(Treg)比率變化的特點及臨床意義。方法 選取膿毒癥患者40例(28d內存活22例，死亡18例)為膿毒癥組，健康人群30例為健康對照組，采用流式細胞儀檢測外周血Treg水平，比較2組Treg水平的差異，以及膿毒癥組治療前后Treg水平的變化。結果 膿毒癥組患者外周靜脈血中Treg占CD+4T淋巴細胞的(8.26±0.34)%，高于健康對照組的(5.40±0.25)%，差異有統計學意義(P<0.05)；膿毒癥患者治療1周后Treg占CD+4T淋巴細胞的(7.65 ±0.65)%，低于治療前的(8.26±0.34)%，差異均有統計學意義(P<0.05)；存活組(n=22)和死亡組(n=18)Treg占CD+4T淋巴細胞比率分別為(8.23±0.34)%和(8.30±0.35)%，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 膿毒癥患者外周血中Treg水平增高，提示調控Treg水平是治療膿毒癥的新方法。

CD127；調節性T細胞；膿毒癥；淋巴細胞；調控

膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克及外科大手術合并感染后常見的并發癥，也是全身炎性反應綜合征、多器官功能障礙綜合征、膿毒性休克最終導致多器官功能衰竭的主要誘因[1]。據統計，美國每10萬人口中就有300例膿毒癥患者，其中30%死于膿毒癥及其嚴重的并發癥，盡管大量實驗性研究和臨床干預措施廣泛采用，膿毒癥的發病率和其相關疾病的病死率仍居高不下且具有增長趨勢[2]，近年來，眾多學者研究發現，膿毒癥患者在病程的某個時期處于免疫抑制狀態[3]。有研究發現，膿毒癥患者表現出遲發超敏反應喪失、病原清除能力下降、易發生繼發感染等免疫抑制情況，這都將成為導致膿毒癥患者病情惡化和死亡的誘因[4，5]。調節性T細胞(Treg)已被證實具有免疫功能及免疫抑制特性的細胞亞群。本研究采用流式細胞儀技術分析膿毒癥患者外周血Treg的比率，探討其臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取天津醫科大學總醫院普外科病房和外科重癥加強護理病房(SICU)膿毒癥患者40例為膿毒癥組，男21例，女19例，年齡(48.1±8.8)歲，其診斷依據2008年華盛頓國際膿毒癥定義會議上由危重病醫學會(SCCM)、歐洲加強治療醫學會(ESICM)、美國胸科醫師協會(ACCP)、美國胸科學會(ATS)和外科感染學會(SIS)等學術團體共同提出的膿毒癥診斷標準。基礎病：重癥肺炎16例，胃穿孔8例，腸瘺5例，導管相關性血液感染5例，急性壞死性胰腺炎4例，腸系膜血管栓塞1例，急性化膿性膽管炎1例。另隨機選取天津醫科大學總醫院普外科工作人員15例、社會健康查體志愿者15例(正常人群)共30例作為健康對照組，男14例，女16例，年齡(45.6±9.4)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器和試劑 日本高速低溫離心機(HATASHI，Japan)，流式細胞儀(FACSCalibur，BD公司)，37℃ 孵化箱(HATASHI，Japan)，PE-Cy5標記的鼠抗人CD4單克隆抗體、FITC標記的鼠抗人CD25單克隆抗體、PE標記的鼠抗人CD127單克隆抗體(BDeBioscience公司，USA)，人類淋巴細胞分離液(北京市鼎國生物科技有限責任公司)，Hank's液及磷酸緩沖鹽溶液(PBS)自行配制。

1.3 觀測項目及方法

1.3.1 標本采集： 膿毒癥組患者確診后第1天以及治療后第7天清晨，對照組1次性清晨空腹，從外周靜脈抽取血液2ml，EDTA抗凝。

1.3.2PBMC分離： 采用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞(PBMC)：于抗凝血2ml內加入等體積的Hank's液進行稀釋混勻，避光環境下，先后將4ml淋巴細胞分離液及稀釋樣本加入離心管內，放入低速離心機內離心，溫度25℃，2 000r/min離心20min，后將乳白色PBMC懸液層轉移至離心管內，加入2倍體積的PBS液重懸并漂洗，反復漂洗2次后，將最終PBMC樣本加入至1.5ml的離心管內，調整細胞計數至1×106/ml。

1.3.3 標記抗體檢測Treg： 在每1ml樣本中各加入PE-Cy5標記的鼠抗人CD4抗體、FITC標記的鼠抗人CD25抗體和PE標記的鼠抗人CD127抗體 20μl，混勻，37℃保溫箱避光孵育30min。

1.3.4 淋巴細胞檢測： 加入PBS液0.5ml后予流式細胞儀檢測。檢測時先根據前向角(FSC)和側向角(SSC)散射光信號，對淋巴細胞群進行設門，每次獲取設門內細胞104個以上并保存數據。見圖1。

圖1 淋巴細胞設門，檢測CD4陽性情況

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計分析。計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，治療前后顯著性采用配對t檢驗。P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

注：A.健康對照組；B.膿毒癥組(治療前)；C.膿毒癥存活組；D.膿毒癥死亡組

3 討 論

3.1Treg的臨床研究 20世紀70年代，研究人員發現了一種具有免疫抑制性質的T細胞——Treg。其所具備的免疫相關特性已成為免疫學領域研究的熱點[6]，Treg所具有的免疫抑制特性使得其在自身免疫性疾病的調節中具有廣泛的應用前景[7]。其相關研究領域已涉及炎性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)及腫瘤相關疾病等。Mclarnon[8]認為IBD與免疫、遺傳、感染等多種因素相互作用有關，其中免疫因素起著關鍵作用，Treg的減少、表面分子表達的缺陷、抑制功能的受損,均與IBD的發生相關[8]。Schneidawind等[9]、Leveson-Gower等[10]先后研究顯示，Treg水平的減低在GVHD的發生過程中起重要作用。Mougiakakos等[11]、Adeegbe等[12]分別研究顯示Treg與腫瘤相關疾病關系密切，Oleinika等[13]對腫瘤免疫逃逸方面的研究顯示，部分腫瘤抗原為自身抗原，Treg有利于自身抗原耐受,通過去除組織特異性Treg使抗腫瘤作用得到增強。

1EsperAM,MartinGS.Extendinginternationalsepsisepidemiology:theimpactoforgandysfunction[J].CriticalCare,2009,13(1):1-3.

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3 戴新貴,姚詠明,艾宇航. 膿毒癥大鼠調節性T細胞凋亡對輔助性T細胞漂移的影響及血必凈注射液的干預作用[J]. 中國危重病急救醫學,2009,21(3):135-138.

4SugithariniV,PremaA,Berla-ThangamE.Inflammatorymediatorsofsystemicinflammationinneonatalsepsis[J].InflammRes,2013,62(12):1025-1034.

5 安瑩波，杜鐵寬，劉瑛，等.血清降鈣素原在急診膿毒癥早期診斷中的意義[J].疑難病雜志,2013,12(7):510-512.

6JiangLN,YaoYM,ShengZY.TheroleofregulatoryTcellsinthepathogenesisofsepsisanditsclinicalimplication[J].JInterferonCytokineRes,2012,32(8):341-349.

7VignaliDA,CollisonLW,WorkmanCJ.HowregulatoryTcellswork[J].NatRevImmunol,2008,8(7):523-532.

8MclarnonA.IBD:regulatoryT-celltherapyisasafeandwell-toleratedpotentialapproachfortreatingrefractorycrohn'sdisease[J].NatRevGastroenterolHepatol,2012,9(10):559.

9SchneidawindD,PieriniA,NegrinRS.RegulatoryTcellsandnaturalkillerTcellsformodulationofGVHDfollowingallogeneichematopoieticcelltransplantation[J].Blood,2013,122(18):3116-3121.

11MougiakakosD,ChoudhuryA,LladserA,etal.RegulatoryTcellsincancer[J].AdvCancerRes, 2010,107:57-117.

12AdeegbeDO,NishikawaH.NaturalandinducedTregulatorycellsincancer[J].FrontImmunol,2013,4:190.

13OleinikaK,NibbsRJ,GrahamGJ,etal.Suppression,subversionandescape:theroleofregulatoryTcellsincancerprogression[J].ClinExpImmunol,2013,171(1):36-45.

14 陸俊杰,葛志軍,戴吉. 膿毒癥患者外周血調節性T細胞變化及其臨床意義[J].中華危重病急救醫學,2013,25(4):242-243.

17PotekhinaAV,ProvatorovSI,SokolovVO,etal.CD4(+)CD25(high)CD127(low)regulatoryTcellsinpatientswithstableanginaandtheirdynamicsafterintracoronarysirolimus-elutingstentimplantation[J].HumImmunol,2011,72(7):553-557.

Study of CD+4CD+25CD127lowregulatory T cells for patients with sepsis

WANGHanxu*,HUWenquan,HANKun,LILi.*DepartmentofSurgery,TianjinDongliDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300300,China

HUWenquan,E-mail:huwq@126.com

Objective To investigate the characteristics and clinical significance of peripheral blood CD+4CD+25CD127lowregulation T cells (Treg) changes ratio in sepsis patients.Methods Select 40 cases with sepsis patients (28 d survived of 22 cases, death of 18 cases) as sepsis group, 30 cases of healthy population as control group, using flow cytometry to detect peripheral blood Treg level, compared the differences between the level of Treg in two groups, before and after treatment Treg level changes.Results Sepsis group’s peripheral blood Treg / CD+4T cell:(8.26±0.34)%,which was higher than the healthy control group (5.40±0.25) %, the difference was statistically significant (P<0.05);sepsispatientsafter1weekoftreatment,Treg/CD+4Tlymphocytes:(7.65±0.65)%,whichwaslowerthanbeforetreatmentof(8.26±0.34)%,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05);survivalgroup(n= 22)anddeathgroup(n=18)Treg/CD+4Tlymphocyteratiowere(8.23 ±0.34)%and(8.30±0.35)%respectively,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05).Conclusion Septic patients’ peripheral blood Treg levels is increased, revealed that regulating Treg level is a new method for treatment of sepsis.

CD127; Regulatory T cells; Sepsis; Lymphocyte; Regulation

天津市應用基礎研究計劃面上項目(No.05YFJMJC14700)

300300 天津市東麗區中醫醫院外科(王晗旭)； 300052 天津醫科大學總醫院普外科(胡文全、韓琨、李莉)

胡文全，E-mail:huwq@126.com

2015-01-30)

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.07.016