Matriptase表達下調對胰腺癌細胞株SW1990侵襲的影響

王楠 楊劍峰 賈振宇 何楊 許春芳

·論著·

Matriptase表達下調對胰腺癌細胞株SW1990侵襲的影響

王楠 楊劍峰 賈振宇 何楊 許春芳

目的探討matriptase基因沉默對胰腺癌細胞株SW1990侵襲力的影響。方法采用脂質體法將不同濃度的靶向matriptase的siRNA(Ma-siRNA)轉染人胰腺癌SW1990細胞株，以轉染陰性對照的siRNA(NC-siRNA)作為對照組。采用熒光定量PCR法和蛋白質印跡法檢測各組細胞matriptase mRNA和蛋白的表達水平，采用Transwell小室檢測細胞侵襲能力，明膠酶譜法檢測細胞matriptase及MMP-9的活性。結果NC-siRNA組及12.5、25、50 nmol/L Ma-siRNA組SW1990細胞matriptase mRNA相對表達量分別為1.000、0.417±0.006、0.233±0.068、0.221±0.092，蛋白表達量分別為0.736±0.066、0.498±0.036、0.341±0.118、0.239±0.050，Ma-siRNA各組細胞matriptase mRNA及蛋白表達量均顯著低于NC-siRNA組，差異具有統計學意義(P值均<0.01)；matriptase活性分別為1.501±0.165、1.211±0.265、0.645±0.165、0.620±0.003，MMP-9活性分別為0.929±0.260、0.484±0.364、0.352±0.113、0.346±0.121，其中25、50 nmol/L Ma-siRNA組細胞的matriptase及MMP-9活性較NC-siRNA組顯著下降，差異有統計學意義(P值<0.05或<0.01)。NC-siRNA組的穿膜細胞數為(256±1)個/200倍視野，25 nmol/L Ma-siRNA組為(109±3)個/200倍視野，25 nmol/L Ma-siRNA組細胞侵襲力較對照組下降(57.4±5.4)%。結論抑制matriptase基因表達可降低胰腺癌SW1990細胞的侵襲能力，其機制可能與matriptase及MMP-9酶活性下降有關。

胰腺腫瘤； 腫瘤侵襲； 絲氨酸蛋白酶類； 基質金屬蛋白酶9

Matriptase是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族成員，主要表達于各種組織的上皮細胞，免疫細胞中也有微量表達[1]。Lee等[2]報道，matriptase的表達量與宮頸癌的臨床分期和病理學分級呈正相關。Uhland等[3]發現，matriptase參與胰腺導管癌的病理進程，抑制matriptase活性可以抑制疾病的進展。本研究通過特異性沉默matriptase基因表達，觀察其對胰腺癌細胞株SW1990侵襲能力的影響。

材料和方法

一、細胞株及實驗材料

白血病細胞株HL60、Namalwa，胰腺癌細胞株SW1990、PaTu-8988、BxPC-3、AsPC-1系唐仲英血液研究中心贈予。HL60、Namalwa在含10%胎牛血清的RIPM-1640培養液中培養、傳代，其他各細胞株均在含10%胎牛血清的DMEM培養液中培養、傳代。靶向matriptase的siRNA(Ma-siRNA)、陰性對照siRNA(NC-siRNA)及熒光標記的siRNA(NC FAM-siRNA)均購自蘇州吉瑪公司(GenePharma)。Ma-siRNA的序列為5′-UGCCAGUCAACAACGUCAATT-3′。鼠抗人matriptase單克隆抗體購自Santa Cruz公司，羊抗鼠HRP標記的二抗購自美國Bioworld公司。Trizol試劑購自Sigma公司，反轉錄試劑盒購自Thermo公司。SYBR green PCR Master Mix購自美國ABI 公司，Transwell小室購自Millipore公司。

二、RT-PCR法檢測細胞株matriptase mRNA表達

收集各對數生長期細胞，用Trizol提取細胞總RNA。采用RT-PCR方法檢測細胞matriptase mRNA表達。根據Genbank中的基因序列設計引物，matriptase上游引物序列為5′-GGCACGAGAAAGTGAATGGC-3′，下游引物序列為5′-GAAGACCTTCTGGACACGCA-3′，產物大小197 bp；內參β-actin上游引物序列為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，產物大小285 bp。引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。先用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。PCR反應條件： 94℃ 4 min，94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 30 s，29個循環。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，BIO-RAD/Gel DocXR成像系統觀察拍照。

三、蛋白質印跡法檢測細胞株matriptase蛋白的表達

收集各對數生長期細胞，細胞裂解液裂解細胞獲取蛋白勻漿，BCA比色法定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測matriptase蛋白表達。最后應用圖像分析儀掃描，以目的條帶與內參GAPDH條帶的灰度值比表示蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

四、Matriptase基因沉默的胰腺癌SW1990細胞建立及鑒定

選取高表達matriptase mRNA的SW1990細胞株對數生長期細胞，以5×105/孔密度接種于6孔板，37℃培養箱中孵育過夜，待細胞融合至70%～90%時，在200 μl無血清DMEM中加入終濃度為12.5、25、50 nmol/L的Ma-siRNA及5 μl lipofectamine 2000混勻，以加入NC-siRNA作為對照。繼續培養24、48 h后收集各組細胞。采用實時PCR及蛋白質印跡法檢測細胞的matriptase mRNA及蛋白表達。實時PCR的反應條件同上，由儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量，ΔΔCt=(Ma-siRNA組Ct值-β-actin組Ct值)-(NC-siRNA組Ct值-β-actin組Ct值)。實驗重復3次，取均值。

五、明膠酶譜檢測細胞matriptase及MMP-9活性

取上述各組培養4 h后的SW1990細胞，換無血清的DMEM繼續培養24 h，收集各組細胞培養上清液。將培養上清液與非還原性上樣緩沖液1∶1混合，置4℃行SDS-PAGE電泳。電泳結束后用2.5%洗脫液洗脫凝膠2次，每次20 min，然后用ddH2O漂洗2次，每次30 min，置孵育液中洗滌30 min，換新鮮孵育液后置37℃孵育42 h。孵育結束后用考馬斯藍染色30 min，脫色2 h，掃描儀掃描獲取各條帶灰度值。實驗重復3次，取均值。

六、Transwell小室檢測細胞侵襲能力

用Matrigel涂布Transwell小室的Polycarbonate膜，凝固后在上室加入200 μl用無血清DMEM重懸的25 nmol/L Ma-siRNA轉染24 h的SW1990細胞(1×105/室)，在下室中加入500 μl含10% FBS的DMEM，置37℃培養箱中培養36 h，用棉簽輕輕擦去上室中未穿膜的細胞，將膜用甲醇固定15 min，結晶紫(碧云天公司)染色10 min。用智能圖像導航儀(奧林巴斯公司FSX100)拍照，200倍光鏡下取5個視野，計數穿膜細胞數。以轉染NC-siRNA的SW1990細胞作為對照。實驗重復3次，取均值。

七、統計學處理

結 果

一、胰腺癌細胞株matriptase mRNA及蛋白表達

胰腺癌細胞SW1990及AsPC-1均有matriptase mRNA及蛋白表達，以SW1990細胞的表達量高，而PaTu-8988細胞不表達；陰性對照的HL60細胞不表達，陽性對照的Namalwa有表達(圖1)。

圖1 HL60(1)、Namalwa(2)、AsPC-1(3)、SW1990(4)、PaTu-8988(5)細胞matriptase mRNA(1A)及蛋白(1B)表達

二、胰腺癌細胞株SW1990的matriptase基因沉默效果

NC-siRNA組及12.5、25、50 nmol/L Ma-siRNA組SW1990細胞的matriptase mRNA表達量分別為1.000、0.417±0.006、0.233±0.068，0.221±0.092；蛋白表達量分別為0.736±0.066、0.498±0.036、0.341±0.118、0.239±0.050(圖2)。Ma-siRNA各組細胞matriptase mRNA及蛋白表達量均顯著低于NC-siRNA組，差異具有統計學意義(P值均<0.01)。

圖2 NC-siRNA組(1)及12.5(2)、25(3)、50 nmol/L(4)Ma-siRNA組SW1990細胞 matriptase蛋白表達

三、SW1990細胞matriptase及MMP-9活性的變化

NC-siRNA組及12.5、25、50 nmol/L Ma-siRNA組SW1990細胞的matriptase活性分別為1.501±0.165、1.211±0.265、0.645±0.165、0.620±0.003，其中25、50 nmol/L Ma-siRNA組細胞的matriptase活性較NC-siRNA組顯著下降，差異有統計學意義(P值均<0.01，圖3)。

NC-siRNA組及12.5、25、50 nmol/L Ma-siRNA組SW1990細胞的MMP-9活性分別為0.929±0.260、0.484±0.364、0.352±0.113、0.346±0.121，其中25、50 nmol/L Ma-siRNA組細胞的MMP-9活性較NC-siRNA組顯著下降，差異有統計學意義(P值均<0.05，圖3)。

圖3 NC-siRNA組(1)及12.5(2)、25(3)、50 nmol/L(4)Ma-siRNA組SW1990細胞matriptase、MMP-9活性(明膠酶譜)

四、Matriptase基因沉默對SW1990細胞侵襲力的影響

NC-siRNA組和25nmol/L Ma-siRNA組的穿膜細胞數分別為(256±1)、(109±3)個/200倍視野，沉默后SW1990細胞的侵襲力下降(57.4±5.4)%(圖4)。

圖4 NC-siRNA組(4A)和25 nmol/L Ma-siRNA組(4B)的穿膜細胞(×200)

討 論

Matriptase最早于1993年在體外培養的乳腺癌細胞培養基中被鑒定出來[4]。編碼matriptase的基因ST14定位于人染色體11q24-25，全長50 900 bp，mRNA全長為3 310 bp，編碼一條855個氨基酸的多肽。研究發現，matriptase與上皮來源的實體腫瘤密切相關，在前列腺[5]、結腸[6]、腎臟[7]等部位的腫瘤均能檢測到matriptase的過表達；部分腫瘤的matriptase高表達與臨床預后不良相關。編碼matriptase蛋白的ST14基因突變或缺失后可導致炎癥性腸病[8]、瑟頓綜合征[9]等疾病。但matriptase在胰腺癌中的作用尚不清楚。

研究發現，matriptase可直接降解細胞外基質或通過激活肝細胞生長因子前體(pro-HGF)[10]和尿激酶型纖溶酶原激活物前體(pro-uPA)[11]降解細胞外基質并促進腫瘤細胞的侵襲及轉移。此外，matriptase增加HGF和c-Met[12]的表達，它們相互作用能增加STAT3磷酸化水平，從而通過PI3K/NF-kB/AKT[13]等信號通路延長腫瘤的存活時間。

本研究結果顯示，胰腺癌細胞株SW1990、AsPC-1表達matriptase，但胰腺癌細胞株PaTu-8988不表達，提示matriptase在胰腺癌細胞中存在異質性。通過siRNA技術特異性沉默SW1990細胞matriptase表達后細胞的matriptase、MMP-9活性降低，侵襲能力明顯下降，提示抑制matriptase基因表達既可抑制matriptase活性，也可抑制MMP-9活性，從而降低胰腺癌細胞株SW1990的侵襲力，表明matriptase基因參與SW1990細胞的浸潤及轉移。

[1] 高利娟, 董寧征, 吳慶宇. Ⅱ 型跨膜絲氨酸蛋白酶的最新研究進展[J]. 基礎醫學與臨床, 2013, 33(7): 915-918.

[2] Lee JW, Yong Song S, Choi JJ, et al. Increased expression of matriptase is associated with histopathologic grades of cervical neoplasia[J]. Hum Pathol, 2005, 36(6): 626-633.

[3] Uhland K, Siphos B, Arkona C, et al. Use of IHC and newly designed Matriptase inhibitors to elucidate the role of Matriptase in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Int J Oncol, 2009, 35(2): 347-357.

[4] Shi YE, Torri J, Yieh L, et al. Identification and characterization of a novel matrix-degrading protease from hormone-dependent human breast cancer cells[J]. Cancer Res, 1993, 53(6): 1409-1415.

[5] Saleem M, Adhami VM, Zhong W, et al. A novel biomarker for staging human prostate adenocarcinoma: overexpression of matriptase with concomitant loss of its inhibitor, hepatocyte growth factor activator inhibitor-1[J]. Cancer Epidemiology Biomarkers Prev, 2006, 15(2): 217-227.

[6] Tsai WC, Sheu LF, Chao YC, et al. Decreased matriptase/HAI-1 ratio in advanced colorectal adenocarcinoma of Chinese patients[J]. Chin J Physiol, 2007, 50(5): 225-231.

[7] Mukai S, Yorita K, Kawagoe Y, et al. Matriptase and MET are prominently expressed at the site of bone metastasis in renal cell carcinoma: immunohistochemical analysis[J]. Human cell, 2014,28(1): 44-50.

[8] Kosa P, Szabo R, Molinolo AA, et al. Suppression of Tumorigenicity-14, encoding matriptase, is a critical suppressor of colitis and colitis-associated colon carcinogenesis[J]. Oncogene, 2012, 31(32): 3679-3695.

[9] Sales KU, Masedunskas A, Bey AL, et al. Matriptase initiates activation of epidermal pro-kallikrein and disease onset in a mouse model of Netherton syndrome[J]. Nat Genet, 2010, 42(8): 676-683.

[10] Gray K, Elghadban S, Thongyoo P, et al. Potent and specific inhibition of the biological activity of the type-II transmembrane serine protease matriptase by the cyclic microprotein MCoTI-II[J]. Thromb Haemost, 2014, 112(2):402-411.

[11] Suzuki M, Kobayashi H, Kanayama N, et al. Inhibition of tumor invasion by genomic down-regulation of Matriptase through suppression of activation of receptor-bound pro-urokinase[J]. J Biol Chem, 2004, 279(15): 14899-14908.

[12] Szabo R, Rasmussen AL, Moyer AB, et al. c-Met-induced epithelial carcinogenesis is initiated by the serine protease matriptase[J]. Oncogene, 2011, 30(17): 2003-2016.

[13] Edelmann J, Klein-Hitpass L, Carpinteiro A, et al. Bone marrow fibroblasts induce expression of PI3K/NF-kappaB pathway genes and a pro-angiogenic phenotype in CLL cells[J]. Leuk Res,2008,32(10):1565-1572.

(本文編輯：呂芳萍)

Effects of matriptase down regulation on invasion of human pancreatic cancer cells SW1990

WangNan,YangJianfeng,JiaZhenyu,HeYang,XuChunfang.

DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospital,SoochowUniversity,Suzhou215006,China

Correspondinganthor:XuChunfang,Email:xcf601@163.com

Objective To investigate the effect of the down regulation of matriptase expression on invasion of human pancreatic cancers cells SW1990. Methods Small interfering RNA targeting at matriptase (Ma-siRNA) was transfected into human pancreatic cancers SW1990 cells, and nonsense siRNA (NC-siRNA) group was used as control. Real time PCR assay and Western blot were used to detect the expression of matriptase mRNA and protein. Transwell assay was used to examine the invasion ability of cancer cells. The enzymatic activity of matriptase and MMP-9 was determined by gelatin zymography assay. Results The expression level of matriptase mRNA in NC-siRNA group, 12.5, 25, 50 nmol/L Ma-siRNA group were 1.000, 0.417±0.006, 0.233±0.068, 0.221±0.092; and the protein expression of matriptase were 0.736±0.066, 0.498±0.036, 0.341±0.118, 0.239±0.050, respectively. The matriptase mRNA and protein expression in Ma-siRNA groups was significantly lower than those in NC-siRNA group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The enzymatic activity of matriptase were 1.501±0.165, 1.211±0.265, 0.645±0.165, 0.620±0.003, and the enzymatic activity of MMP-9 were 0.929±0.260, 0.484±0.364, 0.352±0.113, 0.346±0.121, and the enzymatic activity of matriptase and MMP-9 in 25, 50 nmol/L Ma-siRNA groups was significantly lower than that in NC-siRNA group, and the difference was statistically significant (P<0.05 or <0.01). The number of transmembrane cell was (256±1)/per 200 power field, and it was (109±3)/per 200 power field in 25 nmol/L Ma-siRNA group, and the invasion ability of the cells in 25 nmol/L Ma-siRNA group was decreased by (57.4±5.4)% when compared with that of control group. Conclusions Down-regulation of matriptase inhibits invasion ability of pancreatic cancer SW1990 cells, and this result may be due to the down regulated enzymatic activity of matriptase and MMP-9.

Pancreatic neoplasms; Neoplasm invasiveness; Serine proteases; Matrix metalloproteinase 9

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.04.004

215006 蘇州，蘇州大學附屬第一醫院消化內科(王楠、賈振宇、許春芳)；蘇州大學唐仲英血液學研究中心，教育部血液與血管疾病診療藥物技術工程中心(王楠、楊劍峰、何楊)

許春芳，Email: xcf601@163.com

2014-12-08)