急性胰腺炎患者外周血CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的臨床意義

張代義 高純 謝思明 陳衛(wèi)昌

·短篇論著·

急性胰腺炎患者外周血CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的臨床意義

張代義 高純 謝思明 陳衛(wèi)昌

急性胰腺炎(AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥。關(guān)于AP發(fā)病機(jī)制的多種學(xué)說(shuō)中，免疫細(xì)胞過(guò)度激活-炎性因子學(xué)說(shuō)目前已成為研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究均表明促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失衡是AP發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制[1-2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，在控制自身免疫性疾病進(jìn)展、抑制潛在有害的炎性反應(yīng)及維持免疫穩(wěn)態(tài)等方面起著關(guān)鍵性作用[3-4]，但其在AP患者外周血中的變化鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究動(dòng)態(tài)檢測(cè)AP患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg比例，探討其臨床意義。

一、材料和方法

1．研究對(duì)象：前瞻性收集2014年4月至10月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的72例AP患者，其中男性41例，女性31例，年齡24～89歲，平均年齡(56±17)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷及分類符合2012年版AP分類標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)年齡≥18歲；(3)發(fā)病3 d內(nèi)入院者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)慢性胰腺炎；(2)合并妊娠、外傷、免疫缺陷病、急慢性肝炎、終末期肝腎疾病、惡性腫瘤者；(3)近3個(gè)月內(nèi)使用激素或免疫抑制劑者。選取同期30例體檢健康者作為對(duì)照組，其中男性15例，女性15例，年齡23～79歲，平均年齡(55±16)歲。AP組與對(duì)照組的年齡、性別構(gòu)成比具有可比性。72例AP患者中輕度AP(MAP)54例，中度AP(MSAP)12例，重度AP(SAP)6例。入院后均采取補(bǔ)液、胃腸減壓、抑酸抑酶、營(yíng)養(yǎng)支持等常規(guī)治療及針對(duì)病因的治療，并在病程中輔以中藥治療。本研究方案得到蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，每位受試者均簽署知情同意書(shū)。

2．方法：記錄患者的病因、入院48 hAPACHEⅡ評(píng)分、住院天數(shù)、并發(fā)癥及器官衰竭發(fā)生情況。患者入院后1、3、7 d分別抽取外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝。應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞百分比 (CD4+CD25+FOXP3+Treg/CD4+T)。試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，按說(shuō)明書(shū)操作。即每個(gè)樣品管中加入50 μl血標(biāo)本，然后加入CD4-APC、CD25-FITC抗體，室溫孵育20 min，加入溶血素1 ml，室溫孵育12 min，離心去上清，加入破膜劑1 ml，2～8℃避光45 min，然后加細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記抗體FOXP3-PE，2～8℃避光45 min，PBS洗滌，重懸，上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)low Jo7.6軟件分析。

二、結(jié)果

1．一般情況：72例AP患者病因?yàn)槟懺葱?7例，高脂血癥5例，酒精性3例，其他病因17例。54例MAP患者APACHEⅡ評(píng)分為(3.00±2.22)分，平均住院(9.36±4.52)d；12例MSAP患者為(6.64±2.22)分，(12.86±4.60)d；6例SAP患者為(11.40±4.56)分，(24.00±4.02)d。MAP患者未發(fā)生并發(fā)癥，MSAP患者發(fā)生局部并發(fā)癥4例，全身并發(fā)癥6例，短暫(<48 h)器官衰竭3例； SAP患者均發(fā)生持續(xù)器官衰竭(>48 h)伴局部并發(fā)癥。除2例SAP患者病死外，其余患者經(jīng)治療后均痊愈出院。

2．Treg細(xì)胞比例：對(duì)照組血Treg細(xì)胞百分比為(1.41±0.72)%；入院后1、3、7 d，MAP患者血Treg細(xì)胞百分比分別為(2.80±1.57)%、(3.66±1.62)%、(2.26±0.93)%；MSAP患者為(3.27±1.61)%、(4.24±1.54)%、(5.09±1.50)%；SAP患者為(3.83±0.89)%、(5.18±1.17)%、(6.71±1.38)%(圖1)。各AP組患者血Treg細(xì)胞百分比均高于對(duì)照組， MSAP、SAP患者血Treg細(xì)胞百分比隨時(shí)間的推移逐漸升高。其中MSAP組7 d時(shí)的Treg細(xì)胞百分比較MAP組顯著升高(t=7.387 ，P<0.05)，SAP組各時(shí)間點(diǎn)的Treg細(xì)胞百分比較同時(shí)間點(diǎn)的MSAP組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.416，P<0.05；F=12.896，P<0.01；F=53.416，P<0.001)。

3．AP患者外周血Treg細(xì)胞百分比與持續(xù)器官衰竭的關(guān)系：入院后1、3、7 d，66例無(wú)持續(xù)器官衰竭患者的血Treg細(xì)胞百分比分別為(2.83±1.55)%、(3.73±1.60)%、(3.81±1.56)%；6例有持續(xù)器官衰竭患者為(4.10±0.88)%、(5.20±0.97)%、(6.30±1.27)%，有持續(xù)器官衰竭者血Treg細(xì)胞百分比較無(wú)持續(xù)器官衰竭者顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.133,P<0.05；t=-2.353,P<0.05；t=-5.729,P<0.001)。

討論Treg是免疫系統(tǒng)主要的具有負(fù)向調(diào)控作用的細(xì)胞，它的免疫抑制功能具有細(xì)胞接觸依賴性，可以通過(guò)與其他免疫細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-2來(lái)抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖[6]。另一方面也可以分泌IL-4、IL-10和TGF-β等免疫抑制性細(xì)胞因子，發(fā)揮廣泛的抑制效應(yīng)[7-8]。近年來(lái)的研究表明，燒傷時(shí)Treg細(xì)胞可提高燒傷后機(jī)體免疫系統(tǒng)輔助性(Th)1/Th2細(xì)胞比例，導(dǎo)致機(jī)體傾向Th2型反應(yīng)，并產(chǎn)生大量抑制活性的細(xì)胞因子，造成患者免疫力低下，產(chǎn)生燒傷后膿毒血癥[9-10]。

圖1 對(duì)照組(1A)、MAP組(1B)、MASP組(1C)和SAP組(1D)CD4陽(yáng)性(上)及CD25、FOXP3陽(yáng)性(下)細(xì)胞百分率(流式細(xì)胞儀)

FOXP3(forkhead/winged helix transcription factor)稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，為T(mén)reg細(xì)胞最特異的表面標(biāo)志物。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3缺陷小鼠不能產(chǎn)生Treg細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)FOXP3過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致Treg細(xì)胞亞群的增殖[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，在AP發(fā)病過(guò)程中Treg細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的比例，進(jìn)而調(diào)節(jié)促炎/抗炎遞質(zhì)水平，影響病情向全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及多器官功能障礙綜合征(MODS)進(jìn)展[12-13]。Treg細(xì)胞的增減決定著Th1/Th2細(xì)胞作用主次關(guān)系的轉(zhuǎn)換[14]。本研究結(jié)果顯示，AP患者外周血Treg細(xì)胞百分比較對(duì)照組顯著升高，且SAP患者高于MSAP及MAP患者，表明外周血Treg細(xì)胞與AP的發(fā)生相關(guān)，且與AP病情的嚴(yán)重程度相關(guān)。由于MAP患者無(wú)SIRS表現(xiàn)，抗炎和促炎均處于較低水平，且具有自限性，故到第7天Treg細(xì)胞已明顯下降，但由于患者免疫系統(tǒng)仍受到干擾，因此Treg細(xì)胞比例仍高于正常健康人。MSAP組及SAP組患者Treg細(xì)胞百分比在7d內(nèi)均持續(xù)升高，導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重免疫抑制，但MSAP患者Treg細(xì)胞百分比升高不如SAP患者，表明MSAP患者免疫失衡不如SAP患者嚴(yán)重。另外，本研究結(jié)果顯示AP伴有持續(xù)器官衰竭患者Treg細(xì)胞百分比顯著高于無(wú)持續(xù)器官衰竭者，表明Treg細(xì)胞顯著抑制免疫系統(tǒng)活化及病理性自身反應(yīng)，發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[15]。

由于本研究?jī)H檢測(cè)了AP患者入院后7 d內(nèi)Treg細(xì)胞的變化，納入的中度及重度患者例數(shù)偏少，因此，關(guān)于Treg細(xì)胞在AP中的作用仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。

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(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.04.012

215000 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科

陳衛(wèi)昌，Email: weichangchen@126.com

2015-01-31)