乙型肝炎病毒對人肝癌細胞脂類代謝相關蛋白表達的影響

顏彩玲，彭仙娥，吳云麗，林 旭，陳婉南

乙型肝炎病毒對人肝癌細胞脂類代謝相關蛋白表達的影響

顏彩玲，彭仙娥，吳云麗，林 旭，陳婉南

目的 從mRNA水平和蛋白水平檢測乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)對人肝癌細胞脂類代謝相關蛋白表達的影響。 方法 以HBV細胞株或以1.2倍體HBV基因組瞬時轉染人肝癌細胞株，采用實時定量PCR和Western blot方法驗證人肝癌細胞載脂蛋白AI(apolipoprotein A-I，ApoAI)、載脂蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD 2)、NADPH脫氫酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1，NQO 1)，以及肝型脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding protein 1，FABP 1)和乙酰輔酶A乙酰轉移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2，ACAT 2)等脂類代謝相關蛋白表達水平的改變。結果 HBV細胞株或瞬時轉染HBV均使人肝癌細胞SOD 2、NQO 1基因的mRNA和蛋白表達量下調，FABP 1基因的mRNA和蛋白表達量上調。結論 HBV可影響人肝癌細胞脂類代謝相關蛋白表達，為HBV致肝細胞脂肪變機制的深入研究打下良好基礎。

乙型肝炎病毒；脂類代謝；肝細胞

近年來，乙型肝炎病毒感染與肝細胞脂肪變(hepatocellular steatosis)的關系引起了學者們的關注，并對其相關機制進行了探討[1-2]。本課題組采用雙向電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE)分析RHBV-3細胞株(含1.2倍體HBV基因組重組載體穩定轉染的HepG2細胞株)和RepSal-1細胞株(含對照空載體穩定轉染的HepG2細胞株)蛋白表達差異時發現，HBV對HepG2細胞蛋白表達的影響涉及一大類脂代謝相關蛋白的改變，包括兩種載脂蛋白：載脂蛋白AI(apolipoprotein A-I，ApoAI)、載脂蛋白E(apolipoprotein E， ApoE)，與兩種抗氧化蛋白：超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD 2)、NADPH脫氫酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1，NQO 1)表達減少；以及肝型脂肪酸結合蛋白1(fatty acid binding protein 1，FABP 1)和乙酰輔酶A乙酰轉移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2，ACAT 2)表達增高[3]。現有研究表明脂類代謝相關蛋白表達的異常與肝細胞脂肪變存在一定的聯系[4]。本研究采用實時定量PCR和Western blot方法進一步驗證HBV對上述脂類相關蛋白表達的影響，以探討其作為HBV致肝細胞脂肪變作用機制中分子標志物的可能性，為HBV致肝細胞脂肪變作用機制的進一步研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與細胞 重組質粒pRep-HBV為1.2倍體B基因型HBV基因組克隆于真核表達載體pRep10(Invitrogen公司)，對照質粒pRepSal為pRep10質粒去除表達盒得到；RepSal-1與RHBV-3細胞株為pRepSal與pRep-HBV質粒分別轉染HepG2細胞并經潮霉素篩選獲得，后者能穩定表達HBV表面抗原、e抗原，分泌病毒顆粒并在細胞中持續復制[5]。以上質粒與細胞株由本實驗室構建與保存。肝癌細胞株Huh7、YY及HepG2購自上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基及胎牛血清、Trizol試劑購自Invitrogen公司。實時定量PCR引物由上海博尚生物技術有限公司設計并合成。反轉錄試劑盒、Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix試劑盒購自Stratagene公司。FuGENE 6 轉染試劑、CDP-Star化學發光顯色底物購自Roche公司。RIPA 蛋白裂解液(強)和BCA蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白購自江蘇海門市碧云天生物技術研究所。兔抗人-FABP 1抗體購自Abcam公司；兔抗人-ApoAI抗體、羊抗人-ACAT 2抗體、羊抗人-SOD 2抗體、鼠抗人-NQO 1抗體、鼠抗人-ApoE抗體、鼠抗人-β-tubulin抗體、驢抗羊IgG-AP、羊抗鼠IgG-AP、羊抗兔 IgG-AP均購自Santa Cruz公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自廈門泰京生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及瞬時轉染 RHBV-3和RepSal-1細胞株復蘇后以含250 μg/mL Hygromycin B、10%胎牛血清的DMEM培養液常規培養，使用前每株細胞各接種2.5×106個細胞到60 mm培養皿。HepG2、Huh7、YY細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養液常規培養。轉染前分別按6×105細胞/孔接種于6孔細胞培養板，20 h后取3 μg pRep-HBV和相同分子數的pRepSal質粒，以FuGENE 6 轉染試劑轉染細胞，具體操作見說明書。

1.2.2 實時熒光定量PCR 使用Trizol試劑，將接種后48 h的RHBV-3和RepSal-1細胞，或轉染后48 h的HepG2、Huh7、YY細胞提取總RNA。RNA提取過程及總RNA反轉錄為cDNA均按試劑盒操作說明進行。熒光定量PCR的反應體系如下：正、負引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ROX Reference Dye 0.375 μL ，Brilliant II SYBR Green QPCR master mix 12.5 μL，模板cDNA 2 μL，加水補至25 μL，每份樣品、每個目的基因做3個復孔；反應條件為：預變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，30 s；擴增60 ℃，1 min；共進行45個循環。各目的基因實時定量PCR引物序列見表1。對目的基因的差異表達倍數進行相對定量：每份模板、每個目的基因的3個復孔擴增得到Ct值(熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的擴增循環數)，取其平均值得到一個平均Ct值；每份模板的目的基因的平均Ct值減去該模板內參基因(GAPDH)的平均Ct值，得到ΔCt值；將HBV表達細胞(RHBV-3或pRep-HBV瞬時轉染細胞)的ΔCt值減去對照組(RepSal-1細胞或pRepSal瞬時轉染細胞)的ΔCt值，得到ΔΔCt值；每個目的基因在該HBV表達的模板中的平均相對含量為2-ΔΔCt，相應對照組該值為1。上述實驗重復3次，對提取的RNA分別進行逆轉錄及實時熒光定量PCR擴增，所得實驗結果取平均值，并計算標準差。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.3 Western Blot檢測蛋白表達水平 將接種后48 h的RHBV-3和RepSal-1細胞，或轉染后48 h的HepG2、Huh7、YY細胞以冰預冷PBS洗滌細胞，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑PMSF)裂解細胞，獲得細胞總蛋白并使用BCA蛋白定量試劑盒定量。取等量20 μg蛋白，15% SDS-PAGE電泳分離，電轉移至PVDF膜，以5% BSA封閉過夜。ApoAI抗體、ACAT2抗體、SOD2抗體、NQO1抗體、ApoE抗體分別以5% BSA作1∶200稀釋，FABP1抗體以5% BSA作1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，相應的二抗分別以5% BSA作1∶1 000稀釋，室溫孵育2 h，CDP-Star化學發光法曝光并顯影于X光膠片。β-tubulin作為內參照。上述實驗重復3次，將掃描獲得的灰度值取平均值，并計算標準差。

1.2.4 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，針對同一目的基因，HBV表達細胞與對照的比較分析采用單樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR分析目的基因mRNA水平變化 本實驗室在前期研究中通過雙向電泳測定RHBV-3和 RepSal-1兩株細胞總蛋白質的差異表達情況，并通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF質譜)鑒定出50種差異表達蛋白質，其中包含6種脂類代謝相關蛋白：ApoAI，ApoE，SOD 2，NQO 1表達降低，FABP 1和ACAT 2表達增高。本研究首先以實時定量PCR驗證上述6種基因轉錄水平差異情況，提取1.2倍體HBV基因組穩定表達或瞬時轉染細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，以特異性引物擴增目的基因，相對定量目的基因的差異表達情況，結果顯示(圖1)：與對照細胞株相比，RHBV-3細胞株中FABP1的表達量增高8.6倍，SOD 2、NQO 1及ApoE的表達量分別降低68%，60%和64%，差別均具有統計學意義(P<0.05)；ApoAI和ACAT 2的表達量在RHBV-3細胞株與對照RepSal-1細胞株中的表達差別沒有統計學意義。瞬時轉染結果顯示(圖2)，與pRepSal轉染組相比，轉染pRep-HBV質粒的HepG2、Huh7及YY細胞中，FABP 1表達量分別升高7.3倍，7.2倍，6.3倍；ACAT 2的表達量分別升高7.8倍，5.5倍，8倍；SOD 2表達量分別降低72%，60%，48%；NQO 1表達量分別降低68%，60%，67%；ApoE表達量分別降低75%，10%，33%，差別均具有統計學意義(P<0.05)；ApoAI的表達量在實驗組和對照組中的差別沒有統計學意義。

* Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

圖1 實時定量PCR檢測RHBV-3和RepSal-1細胞目的基因mRNA表達情況

Fig.1 Relative expression level of different genes in RHBV-3 and RepSal-1 cells by real-time PCR

* Compared to the cells transfected with pRepSal,P<0.05.

圖2 實時定量PCR檢測HepG2細胞、Huh7細胞、YY細胞瞬時轉染pRep-HBV和pRepSal后目的基因mRNA表達情況

Fig.2 Relative expression level of target genes in HepG2, Huh7 and YY Cells transfected with pRep-HBV or pRepSal by Real-time PCR

2.2 Western Blot驗證脂類代謝相關蛋白差異表達 提取RHBV-3和RepSal-1細胞總蛋白，以特異性抗體Western Blot檢測上述6種蛋白的差異表達情況，條帶經灰度掃描后，用β-tubulin的灰度值進行標準化，分析結果顯示(圖3)，與RepSal-1細胞相比，RHBV-3細胞ApoE蛋白表達量下調66%，NQO1蛋白表達量下調35%，ApoAI蛋白表達量下調72%，SOD 2蛋白表達量下調54%，FABP 1蛋白表達量上調2.14倍，ACAT 2表達變化不明顯。瞬時轉染pRep-HBV、pRepSal的細胞提取蛋白，重復實驗結果表明(圖4)：與pRepSal轉染組相比較，轉染pRep-HBV質粒的HepG2、Huh7及YY 3株細胞中，NQO 1蛋白表達量均下調，分別下調35%，50%，45%；轉染pRep-HBV質粒的HepG2和Huh7細胞中ApoAI蛋白表達量下調，分別下調33%和38%，但在YY細胞中的表達無明顯變化；SOD 2蛋白表達量在3株細胞均下調，分別下調36%，60%，44%；FABP 1蛋白表達量均上調，上調倍數分別為2.13、1.51和1.55倍；轉染pRep-HBV質粒的HepG2、Huh7和YY細胞中ACAT 2和ApoE蛋白表達量均無明顯變化。

* Compared to RepSal-1 cell strains,P<0.05.

圖3 Western bolt檢測RHBV-3和RepSal-1細胞株ACAT 2、ApoE、NQO 1、ApoAI、SOD 2及FABP 1的表達

Fig.3 Western blot analysis of ACAT 2, ApoE, NQO 1, ApoAI, SOD 2 and FABP 1 protein expression in RHBV-3 and RepSal-1 cell lines

3 討 論

本研究在前期雙向電泳結果的基礎上，通過1.2倍體HBV基因組的穩定轉染細胞株及瞬時轉染實驗驗證，HBV對ApoAI、ApoE、SOD 2、NQO 1、FABP 1、ACAT 2等6個脂類代謝相關蛋白表達水平的影響。結果顯示，在6個脂類代謝相關蛋白中，SOD 2，NQO 1和FABP 1在瞬時轉染實驗中的分析結果與穩定表達HBV蛋白的肝癌細胞株獲得的分析結果完全一致，其中SOD 2、NQO 1基因的轉錄水平和蛋白水平表達下調，FABP 1基因的轉錄水平和蛋白水平表達上調，變化趨勢與雙向電泳分析結果一致[5]。提示SOD 2、NQO 1、FABP 1可能是HBV致肝細胞脂肪變分子機制中重要的標志物，其具體的作用機制有待于進一步的研究。本研究中HBV對ApoE、ApoAI和ACAT 2共3個基因表達水平的影響，在實時定量PCR和Western blot實驗中的結果不完全一致，可能原因為轉錄水平和蛋白水平是基因表達調控的不同層次，蛋白表達水平受更多因素的影響，如mRNA的穩定性，翻譯效率，修飾折疊和蛋白穩定性等因素。

氧化應激在非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)發病機制中起重要作用[1]，SOD 2是線粒體中重要的抗氧化蛋白，是細胞內清除反應性氧化物(Reactive oxygen species，ROS)的主要物質。有研究表明，NAFLD患者肝臟中的SOD活性降低、脂質堆積，脂質過氧化導致丙二醛(malondialde-hyde，MDA)和4-羥基乙酸(4-hydroxyoneal，HNE)釋放，MDA和HNE通過共價鍵與蛋白結合可引起免疫性肝炎[6-7]，SOD酶活性降低的ob/ob小鼠也更易發展為非酒精性脂肪肝炎[8]。NQO 1是體內一種重要的Ⅱ相反應酶，以NAD(P)H為受體，可將NADH或NADPH的電子傳遞給已知或未知的內源性底物及外源性的醌類及其衍生物，發生雙電子還原反應，生成低毒的氫醌類化合物[2]。有研究表明，與野生型小鼠相比，NQO 1基因剔除小鼠NAD(P)H在細胞內堆積從而改變細胞內的氧化還原狀態，表現為抑制磷酸戊糖途徑及加強外周組織脂肪動員，從而導致其肝臟和血漿中甘油三酯含量增加，并出現胰島素抵抗現象[3]，胰島素抵抗與NAFLD的發生密切相關[9]。FABP 1可結合脂肪酸，對脂肪酸具有攝取與轉運功能，在肝臟的脂類轉運中扮演重要角色。有研究表明FABP 1基因剔除小鼠對脂肪酸攝入和利用能力缺陷，降低了生酮作用和脂蛋白的生成，減少了肝臟的脂肪變性[10]。在高脂飼養的小鼠非酒精性脂肪肝形成過程中則發現FABP 1的表達明顯增強，并與肝臟脂肪變程度密切相關[11]。這些發現均提示，FABP 1、NQO 1和SOD 2是參與肝臟脂質代謝的重要基因，當表達異常時可導致肝細胞某些功能的改變，如脂質攝取增加、脂質轉運障礙以及脂質的β氧化受損，從而破壞了肝臟脂質代謝的穩態，進一步導致各種形式脂肪肝。

本研究根據前期雙向電泳實驗的初步結果，從轉錄水平和蛋白水平進一步證實了HBV對脂類代謝相關基因SOD 2、NQO 1、FABP 1的影響。而上述HBV對相關基因表達的影響是由HBV編碼的表面抗原、核心抗原、e抗原及DNA聚合酶等蛋白共同作用的結果，或是由HBV中某個編碼蛋白引起的，以及其具體如何調節這些脂類代謝相關基因表達，并導致最終的生物學效應有待于進一步的深入研究。

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Chen Wan-nan, Email: catherlin_2002@163.com

Effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins in human hepatoma cell lines

YAN Cai-ling,PENG Xian-e,WU Yun-li,LIN Xu,CHEN Wan-nan

(KeyLaboratoryofMinistryofEducationforGastrointestinalCancer,KeyLaboratoryofFujianProvinceforTumorMicrobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China)

In this study, we aimed to investigate the effects of hepatitis B virus on lipid metabolism related proteins both in mRNA and protein levels. To address these issues, six proteins, including apolipoprotein A-I (ApoAI), apolipoprotein E (ApoE), superoxide dismutase 2 (SOD2), NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 (NQO1), fatty acid binding protein 1 (FABP1) and acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2(ACAT2) in hepatoma cells either harboring HBV or transiently transfected with 1.2×length of HBV genome, were detected by real-time PCR or western blot analysis. Results revealed that HBV could down-regulate the expression of SOD2 and NQO1, while up-regulate the expression of FABP1, which suggested that HBV may interfere with the expression of lipid metabolism proteins, and attribute to hepatocellular steatosis.

Hepatitis B virus; lipid metabolism; hepatocytes

國家自然科學基金面上項目(No.81271822)；福建省教育廳科技項目(No. JK2009014)；福建醫科大學博士啟動基金(No.2010BS004)聯合資助課題

陳婉南，Email: catherlin_2002@163.com

福建醫科大學基礎醫學院，“消化道惡性腫瘤”省部共建教育部重點實驗室，福建省腫瘤微生物學重點實驗室，福州 350108

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271822), the Science Project of the Education Department of Fujian Province (No. JK2009014), and the Research Fund for the Doctoral Program of Fujian Medical University (No. 2010BS004)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.014

R373.2

A

1002-2694(2015)06-0560-05

2015-02-27；

2015-05-27