幽門螺桿菌毒素相關蛋白A的EPIYA多態性對胃上皮細胞AGS形態及IL-8表達的影響

劉鹿，王艷春，陶好霞，袁盛凌，王令春，劉純杰

軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071

作為世界第四大癌癥，全球每年新發胃癌100余萬例，中國占42%；胃癌每年死亡人數約80萬，中國占35%。中國是胃癌發病率和死亡率最高的國家之一，發病率和死亡率均2倍于世界平均水平，惡性腫瘤死亡病例中，胃癌位列死亡總數的第二位[1]。

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）是一種可長期定植于人類胃黏膜的革蘭陰性菌，在世界范圍感染率超過50%，是引起胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關的淋巴樣組織淋巴瘤和胃腺癌的重要病原體[2-3]。1994年，幽門螺桿菌被世界衛生組織列為Ⅰ類致癌因子。幽門螺桿菌與胃癌的發展密切相關，其中，幽門螺桿菌毒素相關蛋白A（cytotoxin-associated gene A，CagA）與胃癌的關系已被廣泛深入研究[4-6]。

CagA由cagA基因編碼，基于C端的谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸基序（EPIYA基序）的數量及組合而分類其多態性及分型[7]。EPIYA基序分為A、B、C和D等4類。具有EPIYA-C的CagA屬于東亞型CagA，具有EPIYA-D的CagA屬于西方型CagA[8]。隨著世界人口的流動，目前出現了既不同于東亞型，亦不同于西方型的新型CagA，如美國印第安型（Amerindian）及日本西方型（J-Western），且含新型CagA的菌株范圍有日益擴展的趨勢[9-10]。許多研究者在體外用CagA（+）的幽門螺桿菌感染胃上皮細胞株AGS，可導致AGS細胞出現以細胞伸長和擴散為特征的獨特形態學改變[11]；亦有報道CagA可引起NF-κB激活，使白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）表達增強，從而增加胃腺癌的發生[12]。這可能預示單獨CagA可以作為導致胃癌形成的細菌毒力因子。揭示幽門螺桿菌CagA蛋白致病機制，對于闡明胃癌發生機制具有重要意義。

我們通過設計、人工合成并優化不同cagA基因型，構建相應表達載體，轉染胃上皮細胞AGS后，觀察與分析比較幽門螺桿菌CagA EPIYA多態性對細胞形態及IL-8的影響，為幽門螺桿菌感染致病機制研究、風險評估及根除治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

胃上皮細胞株AGS由本室保存；Fast Pfu DNA聚合酶購自TransGen公司；T4DNA連接酶購自Fer?mentas公司；質粒pcDNA3.1（+）購自Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠PCR產物回收試劑盒購自Promega公司；F12培養基、胎牛血清購自GIBCO公司；細胞裂解液購自Novagen公司；jet PRIME轉染試劑盒、OMEGA無內毒素小量質粒提取試劑盒Ⅰ、蛋白酶抑制劑購自Calbiochem公司；CagA抗體、GAPDH抗體HRP酶標山羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司；ECL底物顯色試劑盒購自TIANGEN公司；OptEIA人IL-8 ELISA檢測試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 各型cagA基因的優化、合成及質粒的構建與制備

參考幽門螺桿菌 Ca52、NCTC11637、98-10、F75、Shi470及PNGhigh85株的CagA設計其C端序列；采用CUTG（Condon Usage Tabulated from Gen?Bank）提供的人密碼子使用頻率表對各序列在GC含量、二核苷酸頻率、密碼子偏性、隱蔽剪接位點及ATTTA序列替換等五方面進行分析。由于CagA蛋白N端極為保守，故N端統一采用98-10株CagA的N端。將優化后的序列交公司合成。采用重組克隆試劑盒法，將各型C端分別和98-10株CagA N端與pcDNA3.1載體進行連接，用質粒提取試劑盒進行各型質粒的提取。

1.3 細胞培養及轉染

采用F12培養液（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養AGS細胞2～3 d，細胞融合達95%左右即可用0.25%胰酶消化，并按1∶3傳代培養。轉染前1 d，在6孔培養板每孔中接種4×105細胞，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，當融合達80%～90%時，按照轉染試劑盒說明進行轉染，每孔加入2 μg各型CagA質粒，轉染后48 h內進行相關檢測。

1.4 CagA表達檢測

轉染后24 h，在每孔中加300 μL細胞裂解液，冰浴5 min后收集細胞裂解物進行SDS-PAGE，電泳結束后轉膜至NC膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗膜5 min，一抗37℃結合1 h，PBST洗膜3次（每次5 min），二抗37℃結合1 h，PBST洗膜3次（每次5 min），加ECL發光試劑檢測目的蛋白，GAPDH為內參蛋白。

1.5 細胞形態觀察

轉染后在不同時間點于光學顯微鏡下觀察AGS細胞的形態，并于轉染后24和36 h對伸長的蜂鳥狀細胞進行計數。不同型進行6次轉染，每次轉染3孔，每孔隨機截取3張鏡下圖像，蜂鳥狀細胞測量與計數采用ImageJ軟件，定義細胞形態針狀突出＞1.5 μm為蜂鳥狀細胞，僅轉染空載體的AGS為陰性對照。結果采用Student-Newman-Keulsa（SNK）法進行統計學分析。

1.6 細胞IL-8表達檢測

轉染后12、36 h分別收集100 μL各型細胞培養上清液，7000 r/min離心10 min，于-80℃儲存，

按照OptEIA人IL-8 ELISA檢測試劑盒說明進行IL-8表達檢測，僅轉染空載體的AGS為陰性對照。結果采用SNK法進行統計學分析。

2 結果

2.1 各型cagA基因的優化、合成及質粒的構建與制備

采用重組克隆試劑盒法，對各基因片段進行擴增、回收，將基因片段與載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選并鑒定攜帶表1所列CagA各型特征重組質粒的重組菌。測序表明序列正確。

2.2 CagA表達檢測

將各型質粒轉染AGS細胞，用Western印跡檢測CagA的表達，采用ImageJ軟件對各型CagA與其對應的內參蛋白GAPDH的比值進行定量分析，發現無統計學差異，說明各型CagA在AGS細胞中均得到了表達，表達水平沒有明顯差異。

2.3 細胞形態觀察

轉染cagA的AGS細胞可出現以細胞伸長和擴散為特征的獨特形態學改變，形似蜂鳥的嘴，被稱為“蜂鳥表型”。在轉染后不同時間點對AGS細胞進行鏡下觀察，可發現與空載體相比較，各型CagA均能引起細胞蜂鳥狀改變的增加（NCTC11637株cagA轉染AGS細胞后各時間點細胞形態見圖2A）。對轉染后24、36 h的“蜂鳥表型”細胞進行計數，結果表明各亞型CagA均能引起發生蜂鳥狀改變的AGS細胞數量增加。與空載體對照相比較，轉染后24和36 h，CagA的6種亞型皆有非常顯著差異（P＜0.001），CagA ABCCC與其余5種亞型有非常顯著差異（P＜0.001），CagA ABDD與 CagA ABC 和 CagA J-West?ern有非常顯著差異（P＜0.001）；24 h時，CagA ABDD與CagA Amerindian有非常顯著差異（P＜0.001）；36 h時，CagA ABD分別與CagA ABC和Ca?gA J-Western有非常顯著差異（P＜0.01）。

表1 CagA分型及世界分布

圖1 Western印跡檢測各型CagA的表達A：各型CagA與相應內參蛋白的表達比；B：Western印跡檢測轉染后空載體及各型CagA的表達；0：pcDNA3.1；1：CagA Amerindian；2：CagA ABD；3：CagA ABC；4：CagA ABDD；5：CagA ABCCC；6：CagA J-Western

2.4 IL-8表達檢測

大量實驗證明，AGS細胞轉染cagA后8～40 h時IL-8處于穩定表達狀態，且36 h左右達表達高峰。于轉染后12、36 h分別收集100 μL細胞培養上清液，ELISA檢測轉染各型cagA后細胞的IL-8表達。統計分析表明，轉染后12 h，較空載體對照，CagA ABDD存在非常顯著差異（P＜0.01）；轉染后36 h，較空載體對照，CagA ABD和CagA J-Western存在非常顯著差異（P＜0.01），CagA ABDD和CagA ABCCC存在非常顯著差異（P＜0.001）；CagA Amerindian與CagA ABD和CagA J-Western分別存在非常顯著差異（P＜0.01），與CagA ABDD和CagA ABCCC分別存在非常顯著差異（P＜0.001）；CagA ABDD 和 CagA ABCCC分別與CagA ABD、CagA ABC和CagA JWestern存在非常顯著差異（P＜0.001）。

圖2 幽門螺桿菌NCTC11637株cagA轉染AGS細胞后各時間點的細胞形態（A）及轉染后各型蜂鳥狀細胞占細胞總數的百分比（B）0：pcDNA3.1；1：CagA ABD；2：CagA ABDD；3：CagA ABC；4：CagA ABCCC；5：CagA Amerindian；6：CagA J-Western

圖3 AGS細胞轉染各型cagA基因后的IL-8表達

3 討論

胃癌是一種由多因素引起的疾病，目前CagA陽性的幽門螺桿菌感染在胃癌發病機制中起著至關重要的作用。CagA分型具有地域分布特征，其致病能力也隨地域的不同而變化。我們構建含不同CagA分型的質粒轉染AGS細胞，旨在消除其他因素對實驗結果的干擾，同時對各型CagA序列進行優化，使CagA更好地在哺乳動物細胞中得到表達[13-14]。

SHP-2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，其作為一種多功能信號傳導蛋白，與細胞生命活動如細胞增殖、分化、移動、死亡的調控密切相關[15-17]。有報道稱東亞型CagA與SHP-2的結合能力更強，更能產生強烈的細胞形態改變[18]。此外，含多個EPIYA-C的西方CagA亦擁有更強的與SHP-2結合的能力[19]。細胞是一切生命活動的基礎，有報道顯示細胞蜂鳥狀形態的改變可引起細胞緊密連接的破壞，從而與胃病嚴重程度相關[6,20]。本實驗中，CagA的存在大量增加了AGS蜂鳥狀細胞的比例，西方型中，蜂鳥狀細胞的形成與EPIYA-C的數量呈正相關；東亞型中，未發現蜂鳥狀細胞的形成與EPIYA-D數量的關系。東亞型較西方型產生了更多蜂鳥狀細胞，但二者間比較不具有統計學差異。目前尚無證據證明CagA與SHP-2相關引起胃癌的機制，但值得探討的是，CagA所誘導的蜂鳥狀細胞改變很可能與胃黏膜組織的癌變密切相關。

IL-8是趨化因子家族的細胞因子，在炎癥形成時可引起中性粒細胞趨化和脫顆粒，引發黏膜局部炎癥，導致胃局部炎癥-胃癌的發生和發展[21]。有研究顯示，CagA陽性的幽門螺桿菌誘導分泌的IL-8水平高于CagA陰性的菌株[22]。大量實驗研究了西方型CagA各型與胃病的關系，鮮有研究進行東亞型CagA與西方型CagA的對比。本實驗中，CagA的存在增加了IL-8的分泌，IL-8的分泌表達同EPIYA-C和EPIYA-D基序的個數呈正相關。

隨著世界人口的流動，目前出現不同于基本分類東亞型和西方型的新型CagA，如在美國出現的CagA Amerindian和在日本沖繩出現的CagA JWestern。本實驗中，CagA Amerindian、CagA JWestern分別與空載體、東亞型及西方型間的差異具有統計學意義，這也暗示CagA Amerindian、CagA JWestern與東亞型及西方型間不僅僅是序列的差異，更有可能是由序列的差異引起了宿主細胞功能的差異。有報道稱CagA Amerindian與輕度胃炎性疾病相關，而與胃癌關系不大[9,23]，這也與本實驗中CagA Amerindian所致IL-8表達量相對較低相呼應。

綜上所述，幽門螺桿菌CagA蛋白可引起胃上皮AGS細胞蜂鳥狀改變及IL-8表達增加，其可變區EPIYA基序C數目的增加與細胞蜂鳥狀改變呈正相關，EPIYA基序C和D數目的增加與IL-8表達呈正相關。

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