白楊素含膦（磷）衍生物對白血病細胞的增殖抑制作用

扶云碧 劉志和 彭愛云

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中，是藥用植物中的主要活性成分之一，亦是人類飲食中的重要組成部分。黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用尤其是抗腫瘤作用引人矚目[1-3]。近年來世界上掀起了黃酮類化合物開發的熱潮。白楊素（chrysin）是被廣泛研究的黃酮類化合物之一，其來源于紫葳科植物木蝴蝶的種子、莖皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，在蜂膠中的含量較高，是蜂膠的主要有效成分。白楊素的化學名為5，7-二羥基黃酮。研究證明，白楊素具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗高血壓、抗糖尿病、抗菌、抗過敏等多種藥理作用[4]。本研究旨在探討新合成的一類膦（磷）酰化白楊素衍生物在體外對白血病細胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Kasumi-1細胞株、K562細胞株、HL60細胞株、Jurkat細胞株、NB4細胞株及U937細胞株購中國科學院上海細胞庫，白楊素含膦（磷）衍生物由中山大學化學與化學工程學院彭愛云提供。PRMI-1640培養基購自美國Gibco公司，新生牛血清從杭州四季青生物工程材料有限公司購買，甲基亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司。

1.2 白楊素含膦（磷）衍生物的合成 以白楊素為先導化合物，按步驟1和步驟2所示的合成路線（圖1），經膦（磷）酰化結構修飾后合成新的系列白楊素含膦（磷）衍生物。結構經核磁、紅外、質譜等確證，純度經高效液相色譜鑒定。化合物合成由中山大學化學與化學工程學院合成。

1.3 細胞培養及原代細胞分離 細胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養基，加1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素，在37 ℃、95%飽和濕度和5% CO2條件下培養，1~2 d換液1次。

選取根據MIC分型診斷為急性白血病的初診患者，抽取骨髓5 mL，分離單個核細胞（BMMNCs）。共分離10例急性白血病患者的BMMNCs。

1.4 MTT實驗 取指數生長期細胞或BMMNCs，實驗在96孔培養板中進行，每孔加入100 μL細胞懸液（2×104個細胞），100 μL用培養基稀釋的藥物。白楊素為陽性對照組、設溶媒對照組及調零組，每組3孔，培養一定時間后，實驗組及對照組每孔加入20 μL MTT液（5 g/L），調零組加入無血清PRMI-1640培養基，混勻，繼續培養6 h，離心去清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，EX-800型酶標儀以450 nm波長測定OD值，計算相對細胞活力，細胞活力（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%，重復3次實驗。

圖1 白楊素含膦（磷）衍生物的合成

1.5 統計學處理 使用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，計量資料數據以（±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白楊素含膦（磷）衍生物的結構及理化性質 合成了12個白楊素膦酸單酯（3a–3l），6個白楊素膦酸（4a–4f），1個白楊素膦（磷）酸6和2個白楊素膦（磷）酸單酯7a，7b，共21個化合物。結構見圖2。該類化合物是未見文獻報道的新化合物，其構效關系顯示有更強的抗腫瘤活性、較好的水溶性、更高的生物利用度，其結構經核磁、紅外、質譜等確證，純度經高效液相色譜鑒定，均達到99.5%以上，溶解度經高效液相色譜法測定為52.3-138.6 μm。

圖2 白楊素含膦（磷）衍生物

2.2 白楊素含膦（磷）衍生物對Kasumi-1細胞增殖抑制活性篩選 為了篩選出增殖抑制活性較強的化合物，參照文獻[5]報道先導化合物——白楊素抑制細胞活性的有效濃度，并以其作為陽性對照，12個化合物分別以100 μm作用細胞48 h，MTT試驗檢測細胞活性。結果見表1，衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b對Kasumi-1細胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b對細胞的抑制活性遠遠高于先導化合物白楊素，比較差異有統計學意義（P<0.01）。

表1 白楊素膦（磷）酸衍生物對Kasumi-1細胞的增殖抑制率

以白楊素（chrysin）為對照，100 μm的3c、7a分別作用Kasumi-1細胞 0、12、24、36、48、60 h，結果見圖 3。100 μm的3c作用36 h細胞活性最低，100 μm的7a作用48 h細胞活性最低。衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制活性呈時間依賴性，且均強于白楊素，比較差異有統計學意義（P<0.01）。0、25、50、75、100 μm 的 3c、7a 分別作用Kasumi-1細胞48 h，結果見圖4。衍生物3c在50 μm濃度時，細胞活性達到最低，衍生物7a在100 μm濃度時，細胞活性最低。衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制活性呈濃度依賴性，且均強于白楊素，比較差異有統計學意義（P<0.01）。白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制的時效關系及量效關系見圖3和圖4。

圖3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制的時效關系曲線

圖4 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制的量效關系曲線

2.3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對多個白血病細胞株的增殖抑制活性 為了探討衍生物3c、7a對其他白血病細胞株的活性，選用衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞株有效作用時間及濃度，分別作用于Jurkat細胞株、NB4細胞株、K562細胞株、HL60細胞株及U937細胞株，MTT法檢測細胞活性。結果見圖5、圖6。衍生物3c、7a對以上細胞株的增殖均有明顯的抑制作用，且呈時間及濃度依賴性。與對照組比較，作用時間48 h時，25 μm衍生物3c即對U937細胞產生明顯的增殖抑制作用；50 μm濃度時對Jurkat細胞株、NB4細胞株、K562細胞株及HL60細胞株有明顯的增殖抑制作用，差異具有統計學意義（P<0.01）。從時效關系方面看，與對照組比較，100 μm的3c作用24 h后，對U937細胞株及Jurkat細胞株有明顯的增殖抑制作用；作用36 h后對NB4細胞株、K562細胞株及HL60細胞株有明顯的增殖抑制作用，差異具有統計學意義（P<0.01）。不同濃度的衍生物7a作用各細胞株48 h，25 μm濃度時對HL60細胞及U937細胞即有明顯增殖抑制效果，比較對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；50 μm濃度時K562細胞及NB4細胞有顯著增殖抑制效果，比較對照組，差異有統計學意義（P<0.01），而Jurkat細胞則在75 μm時出現明顯增殖抑制作用。100 μm的7a作用各細胞株時效關系曲線顯示，作用24 h，NB4細胞即出現一定的增殖抑制效果，比較對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；作用36 h，除U937細胞外，其余細胞均出現顯著增殖抑制作用，比較對照組，差異有統計學意義（P<0.01）；U937細胞出現一定程度增殖抑制作用，但與對照組比較，差異無統計學意義；U937細胞在48 h后出現顯著增殖抑制作用，比較對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.4 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對AML患者BMMNCs的增殖抑制作用 10例初診的急性白血病，其中M2a 4例，M5 1例，B-ALL 2例，T-ALL 2例，慢粒急變1例，分離骨髓單個核細胞，用不同濃度的白楊素含膦（磷）衍生物3c或7a處理48 h，取10例患者各濃度的OD值平均數做曲線，結果見圖7。與細胞株結果類似，衍生物3c及7a對急性白血病患者的骨髓原代細胞均有明顯的增殖抑制作用，且為濃度依賴性。

3 討論

許多研究者對從植物中篩選出的天然黃酮類化合物（如葛根總黃酮、姜黃素、金蓮花黃酮、染料木黃酮等）進行了廣泛研究，發現其在體內外對多種白血病細胞均有一定的活性[6-7]，但是天然黃酮存在活性偏低、類藥性差等缺點。為了提高其抗腫瘤活性，適應臨床應用，各種各樣的黃酮衍生物被合成[8-9]。文獻報道最成熟的為國外研究者合成的Flavopiridol（夫拉平度，黃酮 L86-8275），Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗已證實此藥單用或與其他化療藥物合用對難治復發性急性或慢性白血病均有肯定療效[6，10]。

圖5 白楊素含膦（磷）衍生物3c對各細胞株的增殖抑制活性

圖6 白楊素含膦（磷）衍生物7a對各細胞株的增殖抑制活性

圖7 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對AML患者BMMNCs的增殖抑制作用

近年來許多國內外學者對白楊素衍生物的合成方法和生理活性進行了研究，對白楊素進行硝化、烷基化、羥甲基化、氟甲基化、膦（磷）酰化后合成的部分衍生物具有較強的抗腫瘤活性，在體外對許多腫瘤細胞都有明顯的增殖抑制作用，如人胃癌SGC-7901 細胞、人肺癌A549 細胞、人肝癌HepG2細胞及HepB3細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人鼻咽癌CNE-2細胞、人結腸癌（HT-29）細胞、人類小細胞肺癌NCI2H446細胞、人急性粒細胞性白血病HL-60細胞、人急性T淋巴細胞白血病Jurkat 細胞、急性白血病（M5）U937細胞等[5，11-13]。白楊素膦（磷）酰化結構修飾的報道較少，陳曉嵐等[14]對白楊素進行了含膦（磷）改造，共合成出4種新的化合物，他們的研究結果表明，白楊素含膦（磷）衍生物與溶菌酶具有更強的親和力。張婷等[15]合成了白楊素四乙基二膦（磷）酸酯，并發現白楊素和白楊素四乙基二膦（磷）酸酯對宮頸癌Hela細胞軟瓊脂的集落形成有明顯抑制作用，能誘導并促進宮頸癌Hela細胞發生分化，且白楊素四乙基二膦（磷）酸酯在作用效果方面較白楊素明顯，該研究提示膦（磷）酸基團的添加增強了抗腫瘤活性。

筆者通過化學法，將膦酸或膦（磷）酸基團引入到白楊素側鏈中，新合成21個未見文獻報道的白楊素含膦（磷）衍生物。這些白楊素含膦（磷）衍生物具備以下優點：（1）它們較白楊素具有更好的水溶性。預期在體內能較好的被吸收，可以彌補大多數天然黃酮因水溶性較差而導致生物利用率低的不足。（2）含膦（磷）基團是一些抗骨質疏松、抗病毒、抗腫瘤等藥物分子的藥效團，白楊素又具有廣泛生物活性，所合成的白楊素含膦（磷）衍生物應用了藥效團拼合原理，可能具有更好的藥理活性。通過體外細胞增殖抑制試驗，從新合成的白楊素含膦（磷）衍生物中篩選出對急性白血病（M2）細胞株Kasumi-1增殖抑制作用較強的2個衍生物（3c、7a），這兩個化合物100 μm濃度作用48 h對白血病細胞的增殖抑制率分別為82.64%、79.23%，白楊素同等條件下對白血病細胞的抑制率為47.39%。此后，用衍生物3c及7a分別處理多個細胞株及急性白血病患者的骨髓原代細胞，發現，白楊素含膦（磷）衍生物3c及7a對檢測的多個白血病細胞株及患者骨髓原代細胞均有明顯的增值抑制作用，說明該兩個衍生物有體外抗白血病活性，有進一步進行體內抗腫瘤活性研究的價值。

[1] Karp J E，Garrett-Mayer E，Estey E H，et al.Randomized phase Ⅱ

study of two schedules of flavopiridol given as timed sequential therapy with cytosine arabinoside and mitoxantrone for adults with newly diagnosed，poor-risk acute myelogenous leukemia[J].Haematologica，2012，97（11）：1736-1742.

[2] Bose P，Perkins E B，Honeycut C，et al.Phase Ⅰ trial of the combination of flavopiridol and imatinib mesylate in patients with Bcr-Abl+ hematological malignancies[J].Cancer Chemother Pharmacol，2012，69（6）：1657-1667.

[3] Woyach J A，Lozanski G，Ruppert A S，et al.Outcome of patients with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia treated with flavopiridol：impact of genetic features[J].Leukemia，2012，26（6）：1442-1444.

[4] Stephens D M，Ruppert A S，Blum K，et al.Flavopiridol treatment of patients aged 70 or older with refractory or relapsed chronic lymphocytic leukemia is a feasible and active therapeutic approach[J].Haematologica，2012，97（3）：423-427.

[5]王錚華，梁統，李濤，等.白楊素對人鼻咽癌細胞CNE-2增殖的抑制作用[J].中國藥科大學學報，2013，44（1）：93-96.

[6] Karp J E，Smith B D，Resar L S，et al.Phase 1 and pharmacokinetic study of bolus-infusion flavopiridol followed by cytosine arabinoside and mitoxantrone for acute leukemias[J].Blood，2011，117（12）：3302-3310.

[7] Masayuki N，Kaori T，Yuzo T，et al.Increased bioavailability of rricin-amino acid derivatives via a prodrug approach[J].J Med Chem，2011，54（5）：1529-1536.

[8] Hwang D，Park H J，Seo E K，et al.Effects of flavone derivatives on antigen-stimulated degranulation in RBL-2H3 cells[J].Chem Biol Drug Des，2013，81（2）：228-237.

[9] Suzuki R，Tanaka T，Yamamoto M，et al.In search of new biological activities of isolates from odontoglossum harvengtense 'tutu'[J].In Vivo，2012，26（6）：993-999.

[10] Karp J E，Garrett-Mayer E，Estey E H，et al.Randomized phaseⅡ study of two schedules of flavopiridol given as timed sequential therapy with cytosine arabinoside and mitoxantrone for adults with newly diagnosed，poor-risk acute myelogenous leukemia[J].Haematologica，2012，97（11）：1736-1742.

[11] Zeng Y B，Yang N，Liu W S，et al.Synthesis，characterization and DNA-binding properties of La （Ⅲ） complex of chrysin[J].J Inorg Biochem，2003，97（3）：258-264.

[12]徐成坤，陽波，曹建國.白楊素誘導肝癌Hep3B細胞凋亡機制研究[J].醫藥導報，2014，33（3）：295-298.

[13]文紅波，曹運長，虞佳，等.白楊素對人肝癌HepG2細胞的誘導分化作用[J].中國生化藥物雜志，2014，2（34）：33-36.

[14]陳曉嵐，張守仁，袁金偉，等.白楊素的磷酰化結構改造及與溶菌酶的弱相互作用[C].中國化學會第十二屆全國應用化學年會論文集，2011.

[15]張婷，陳曉嵐，屈凌波，等.白楊素和它的四乙基二磷酸酯對人宮頸癌Hela細胞增殖和核基質蛋白影響的研究[J].藥物生物技術，2005，12（5）：312-316.