釀酒酵母組成型表達甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1及相關性質研究

王 鈺,陳量量,杜 婷,李 艷,嚴 明,郝 寧,許 琳

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

釀酒酵母組成型表達甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1及相關性質研究

王 鈺,陳量量,杜 婷,李 艷*,嚴 明,郝 寧,許 琳

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

本研究將釀酒酵母穿梭質粒pESC-Leu的誘導型啟動子GAL1和GAL10分別替換為PGK1和TEF1啟動子,構建了組成型雙啟動子表達載體pESCD,再將甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的編碼基因亞克隆到pESCD的SalI和XhoI酶切位點之間,構建了組成型表達UGT76G1的重組質粒pESCD-UGT。將pESCD-UGT轉化到釀酒酵母YPH499中進行表達,結果確定該重組酵母在SD-L液體培養基培養24h達到穩定期,菌體培養8h蛋白表達量高,選用1%的甲苯作為重組菌全細胞催化的通透劑時,催化15h產生288mg/L的萊鮑迪甙A,其產量是對照組的5倍。

釀酒酵母,組成型啟動子,糖基轉移酶UGT76G1,全細胞催化,萊鮑迪甙A

植物來源的UDP-葡萄糖基轉移酶(UGTs)是糖基轉移酶家族中的一個重要分支。通過該酶的轉糖基作用,有利于改變受體分子的穩定性、可溶性,提高解毒功能等。每種植物中都有多種UGTs,它們對底物的作用位點具有高度的特異性[1]。其中,糖基轉移酶UGT76G1能將甜菊糖中具有后苦味的甜菊甙(Stevioside,St甙)通過一步糖基化反應生成萊鮑迪甙A(Rebaudioside A,RA甙)[2]。RA甙是一種無毒、安全、高甜度的天然甜昧劑,口味純正[3-4],得到歐美國家的接受和推崇。市售甜菊糖一般以St甙為主要組分,但其略帶甘苦味影響了甜菊糖的口感。因此,提高RA甙在甜菊糖總甙中的相對含量有助于改善甜菊糖味質。

在UGT76G1所催化的糖基轉移反應中需要以昂貴的尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作為糖基供體,必然影響RA甙酶促合成應用的經濟性。全細胞催化技術利用受細胞壁保護的胞內酶系,穩定性更好,同時避免向反應體系中額外添加UDPG,降低了生產成本,在生物催化領域中具有很大的優勢。在本實驗室前期進行的全細胞催化合成RA的工作中[5],由于采用pESC-Leu作為表達載體,該載體的GAL1和GAL10啟動子受半乳糖誘導,受葡萄糖阻遏[6-8],因此重組酵母的培養和重組酶的表達一般分階段進行,并且需要加入半乳糖作為誘導劑,從而實驗周期過長,操作繁瑣,不利于擴大生產[9-10]。本研究中用組成型啟動子PGK1和TEF1分別替換pESC-Leu的GAL1和GAL10啟動子[11],構建了新的表達載體pESCD。再將甜葉菊糖基轉移酶UGT76G1的編碼基因克隆到pESCD載體,用其轉化釀酒酵母YPH499獲得組成型表達UGT76G1的重組酵母,并考察了該重組考察重組菌的生長與產酶性質,初步驗證其全細胞催化甜菊甙合成萊鮑迪甙A的能力。這一工作縮短了重組菌培養及重組酶表達的周期,無需誘導劑,有利于降低生產成本。

1 材料與方法

1.1 試劑

實驗所用基因和引物 由南京金斯瑞公司合成;CloneEZ PCR Cloning Kit 購自南京金斯瑞公司;限制性內切酶 購于NEB公司;TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶和2000、15000DNA Marker 購自Takara公司;質粒抽提試劑盒、DNA片段純化與膠回收試劑盒 購于上海申能博彩有限公司;St甙和 RA甙購自曲阜海根甜菊制品有限公司。

1.2 菌株和質粒

大腸桿菌菌株E.coliDH5α 和釀酒酵母菌株saccharomycescerevisiaeYPH499為本實驗室保藏,pMDTM-18T載體購自TaKaRa公司;pYES2-UGT為本實驗之前構建的帶UGT76G1糖基轉移基因的重組質粒。

1.3 培養基

大腸桿菌LB培養基:蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化鈉10g/L;釀酒酵母完全培養基YPD:酵母提取物10g,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L;釀酒酵母選擇培養基SD-L(SD基本培養基[12]缺乏亮氨酸),其中碳源為20g/L葡萄糖。

1.4 實驗方法

1.4.1 組成型表達載體的構建 在數據庫National Center for Biotechnology Information(NCBI)上檢索到TEF1和PGK1的基因序列,并參考文獻[11]設計引物如下:

P1:5′-CCATTCTTTGAAGGTACTTCCGGCCGG CCGCACACACCATAGCTTCAAA-3′;

P2:5′-GTTGTTGCGGCCGCTTGTAATTAAAAC TTAGATTAGATTGC-3′;

P3:5′-GGAAGTACCTTCAAAGAATGG-3′;

P4:5′-GTTGTTGGATCCTTGTTTTATATTTGTT GTAAAAAGTAG-3′

其中P2和P4分別帶有NotI、BamH I酶切位點。

以YPH499基因組為模板分別用引物P1和P2 PCR擴增片段pTEF1,引物P3和P4 PCR擴增pPGK1片段。PCR在50μL體系中進行,反應條件為:98℃預變性5min;98℃變性10s,58℃退火15s,72℃延伸1min,30個循環;72℃延伸7min。獲得兩個pTEF1和pPGK1的PCR擴增片段后,再使用融合PCR技術將pTEF1和pPGK1反向融合起來,得到新的目的片段。融合PCR的模板為pTEF1與pPGK1的PCR產物按等濃度的混合物,PCR體系50μL引物為P2、P4。將融合的PCR產物及表達質粒pESC-Leu用NotI、BamH I 限制性內切酶進行雙酶切反應,再純化回收酶切后片段進行連接,連接液轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,用經酶切鑒定的陽性克隆送南京金斯瑞公司測序確認,獲得質粒pESC-LeuD簡稱pESCD。

1.4.2 引物設計與合成 根據UGT基因序列和CloneEZ PCR Cloning Kit的引物設計原理合成引物如下:

P5:5′-CTATAGGGCCCGGGCGTCGACATGGAA AATAAGACTGAAACTACTG-3′;

P6:5′-GCGGTACCAAGCTTACTCGAGTTATAAT GATGAAATATAAGAAACC-3′

P5和P6分別帶有SalⅠ、XhoⅠ酶切位點。

以pYES2-UGT質粒為模板,用引物P5和P6,PCR擴增UGT基因。PCR在50μL體系中進行,反應條件為:98℃預變性5min;98℃變性10s,62℃退火15s,72℃延伸2min,30個循環;72℃延伸7min。將經SalI、XhoI雙酶切后的質粒pESCD純化回收,與純化后的PCR產物用CloneEZ Enzyme進行連接,連接液轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,用經酶切鑒定的陽性克隆送南京金斯瑞公司測序確認,獲得重組質粒pESCD-UGT。

1.4.3 重組UGT76G1的表達 將重組質粒pESCD-UGT采用化學轉化法轉入到釀酒酵母YPH499感受態細胞中,30℃培養約48h,在SD-L篩選平板上得到重組酵母YPH499(pESCD-UGT),挑取單菌落到SD-L培養液中,30℃振蕩培養活化。種子液按終OD600為0.4的接種量轉接于100mL新鮮SD-L液體中,30℃、200r/min培養8、12、16、24h。室溫6000r/min離心10min收集菌體、用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)懸浮洗滌后備用。

1.4.4 粗酶液的制備 取適量上述細胞加液氮反復研磨,用300μL 0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)重懸樣品,4℃、12000r/min離心15min。上清即為粗酶液,進行SDS-PAGE凝膠電泳實驗和酶催化實驗。

1.4.5 粗酶催化反應 在3mL的反應體系中(1.2mmol/L St甙、4mmol/L UDPG、3mmol/L MgCl2、10μg/mL BSA、0.89mg粗酶、pH7.2),加入粗酶液反應,30℃反應每隔1h取次樣,高溫加熱5min終止反應。12000r/min離心1min后上清液用高效液相色譜(HPLC)進行分析[12]。

1.4.6 全細胞催化方法 取30℃培養24h的重組釀酒酵母YPH499(pESCD-UGT)的濕菌體,用磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后轉移至50mL三角瓶中,在10mL體系(0.1mol/L磷酸鉀緩沖溶液,pH7.2)中加入終濃度為40g/L的葡萄糖,底物St甙2g/L,MgCl26g/L,15g/L檸檬酸鈉,并分別加入1%甲苯和10g/L普朗尼克F-68,于37℃,200r/min條件下進行全細胞催化反應。5、15、24h取樣離心去除菌體,上清95℃煮沸10min,樣品-20℃保存待液相分析。

1.4.7 色譜分析條件 色譜柱:Lichrospher NH2柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為乙睛∶水(80∶20,V∶V),用冰醋酸酸調節pH至4.56;流速:1mL/min;柱溫:40℃;檢測波長:210nm。

2 結果與討論

2.1 pESCD組成型載體的構建與鑒定

以YPH499基因組為模板,經PCR反應擴增得到片段pPGK1、pTEF1,再使用融合PCR技術將pTEF1和pPGK1反向連接,得到新的目的基因片段,純化后的PCR片段用NotI、BamH I雙酶切,回收該片段,與同樣酶切處理的質粒pESC-Leu連接。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,提取質粒用BamH I和NotI對所提的重組克隆菌進行雙酶切,酶切結果見圖1。4號重組質粒經酶切后有明顯的目的基因的條帶(1.4kb左右),經測序后鑒定為陽性克隆。構建好的重組質粒pESCD如圖2所示。

圖1 pPGK1&pTEF1融合啟動子的酶切驗證Fig.1 pPGK1&pTEF1 fusion promoter enzyme cutting test 注:1～3:帶有pESC-Leu載體的假陽性克隆菌;4:帶有pESCD載體陽性克隆菌;5:DNA Marker DL2000。

圖2 空質粒pESCD構建示意圖Fig.2 Construction of plasmid pESCD

2.2 表達重組子pESCD-UGT的構建與鑒定

以pYES-UGT質粒為模板,經PCR反應擴增得到UGT片段,再使用SalⅠ、XhoⅠ雙酶切pESCD質粒,純化回收該質粒與PCR產物,用CloneEZ Enzyme連接純化后的pESCD質粒和PCR產物。將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞,提取質粒用BamHⅠ對所提的重組克隆菌進行雙酶切,酶切結果見圖3,1號重組質粒酶切后有明顯的條帶,約750bp,與預期一致。構建好的重組載體pESCD-UGT如圖4所示。

圖3 酶切pESCD-UGT鑒定Fig.3 Enzyme digestion of pESCD-UGT注:1:pESCD-UGT酶切產物;2:對照pESCD-UGT;3:DNA Marker DL15000。

圖4 重組質粒pESCD-UGT構建示意圖Fig.4 Construction of recombinant plasmid pESCD-UGT

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳結果

由細胞破碎液上清的SDS-PAGE凝膠電泳圖(圖5)可知,與泳道1相比,泳道4、5在大約52ku處有外源蛋白表達條帶,與UGT分子量一致,說明UGT76G1已在重組菌YPH499(pESCD-UGT)中成功表達。通過對比泳道4～7可知在重組菌處于對數中期(培養8h)時,目標蛋白UGT61G1表達量最高。目標蛋白表達量隨培養時間延長而降低,該結果與文獻[11]報道的PGK1啟動子的性質吻合。

圖5 細胞破碎液上清SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of the clear liquid of the cell disruption注:1,Marker-RM013;2,培養24h的重組菌YPH499(pESCD);4～7,分別為培養8、12、16和24h的重組菌YPH499(pESCD-UGT);8,Marker-R0571。

2.4 重組菌生長與殘糖量的確定

如圖6所示,釀酒酵母YPH499(pESCD-UGT)以半皿/100 mL接入SD-L培養基時,在16h后對數期基本結束進入穩定期,其OD600達到7.84。而培養24h時,培養基內葡萄糖基本耗盡,此時重組菌為穩定期。對重組菌生長狀況的初步研究為重組蛋白表達條件尤其是表達時機的選擇奠定了基礎。

圖6 重組菌YPH499(pESCD-UGT)生長狀況與殘糖關系Fig.6 Relationship of the growth and glucose concentration of recombinant

2.5 重組菌與對照菌的催化能力比較

實驗結果表明,對照菌(pESCD)本身也能夠催化生成RA甙,在4h后,重組酵母菌催化能力遠大于原始菌,是原始菌的7～10倍。原始菌也能催化合成RA甙,可能是其具有相似結構酶活中心的糖基轉移酶。

圖7 重組菌YPH499(pESCD-UGT)與YPH499(pESCD)酶催化合成RA甙比較Fig.7 Comparison of crude enzyme catalytic ability in YPH499(pESCD-UGT)and YPH499(pESCD)

2.6 重組菌YPH499(pESCD-UGT)的菌齡對粗酶催化能力的影響

由實驗結果知:收集SD-L培養基中培養8h的菌體,處理后其粗酶催化能力最高,反應4h后可催化產生300mg/L RA甙,粗酶催化能力隨所用重組細胞的菌齡的增長而降低,這與重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜(圖5)顯示的結果相一致,培養8h的細胞中重組酶活力最高,隨著培養基中葡萄糖消耗,PGK1啟動子作用下的重組酶的活力隨培養時間延長而降低[11]。

2.7 全細胞催化反應

將表達后的重組菌菌體離心,進行全細胞催化反應。結果如圖9所示,甲苯在此轉化體系中表現出較佳的通透性,催化能力是對照組的5倍。通透劑甲苯的加入,使底物St甙進入細胞內,在UGT糖基轉移酶的催化下釀酒酵母利用葡萄糖,將St甙轉化為RA甙。采用重組菌催化15h能產生288mg/L的RA甙,24h后RA甙產量略微降低為276mg/L?？赡苁怯捎赗A甙在酵母催化體系中不穩定。

圖8 重組菌不同菌齡粗酶液催化能力比較Fig.8 Enzyme catalytic ability of the recombinants of different culture durations

圖9 不同通透條件下全細胞催化St甙合成RA甙Fig.9 The influence of different cell surfactant on the whole cell transformation

3 結論

本研究成功實現了糖基轉移酶UGT76G1在釀酒酵母體系的組成型表達,重組菌在SD-L液體培養基中培養16h后對數期基本結束進入穩定期,培養24h后,培養基內葡萄糖基本耗盡。培養8h的重組菌的粗酶液中,目標蛋白量及其酶催化能力優于更長時間培養的重組菌。選用1%甲苯比F-68的細胞通透效果更好,催化反應在24h內產物達到287.5mg/L最大值。后續研究中可考慮對組成型啟動子進行優選,使重組菌外源蛋白的表達水平與菌體生長相協同,進一步提高重組菌全細胞催化St甙產RA甙的能力。

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Constitutive expression and characteristics ofglycosyltransferase UGT76G1 inSaccharomycescerevisiae

WANG Yu,CHEN Liang-liang,DU Ting,LI Yan*,YAN Ming,HAO Ning,XU Lin

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

In this study,a new expression vector pESCD which contains the two constitutive promoters,pPGK1 and pTEF1 that replaced the original induced promoter GAL1/GAL10 in pESC-Leu,was designed and constructed. The synthetic glycosyltransferase UGT76G1 coding gene was inserted into the restriction sites,SalI andXhoI of pESCD to construct the recombinant plasmid pESCD-UGT,which was then transformed into theSaccharomycescerevisiaestrain YPH499. The results confirmed that the recombinant cells grew into the stable phase when cultured for 24h and the highest expression of the recombinant protein was observed when cultured for 8h in SD-L. In case of 1% methylbenzence as the cell permeating agent,288mg/L RA was produced after reaction for 15h using the whole-cell catalyst,which was 5 times higher than that of thecontrol group.

Saccharomycescerevisiae;constitutive promoter;glycosyltransferase UGT76G1;whole cell transformation;rebaudioside A

2014-11-05

王鈺(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：生物催化。

*通訊作者:李艷(1975-)，女，博士，副研究員，研究方向：工業生物催化。

國家自然科學基金項目(21106068)；江蘇省自然科學基金項目(BK2011801)；高等學校博士學科點專項科研基金(20113221120002)和江蘇省普通高校自然科學研究項目(10KJB530004)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)13-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.025