響應面法優化脈沖強光對巴氏奶霉菌的滅菌工藝

王 勃,朱力杰,惠麗娟,劉 賀,馬 濤

(渤海大學化學化工與食品安全學院,渤海大學糧油科學與技術研究所,遼寧錦州 121013)

響應面法優化脈沖強光對巴氏奶霉菌的滅菌工藝

王 勃,朱力杰,惠麗娟,劉 賀,馬 濤*

(渤海大學化學化工與食品安全學院,渤海大學糧油科學與技術研究所,遼寧錦州 121013)

為研究脈沖強光殺菌技術對巴氏奶殺菌的效果,以巴氏奶為研究對象,用霉菌滅菌率作為衡量脈沖強光滅菌技術的指標。在單因素實驗基礎上,選取閃照次數、閃照距離、閃照能量和樣液厚度為自變量,霉菌滅菌率為響應值,利用Box-Benhnken中心組合設計原理和響應面分析法,確定最佳條件為閃照次數35次、閃照距離12.8cm、閃照能量300J、樣液厚度2mm。在此條件下,霉菌滅菌率達到99.97%。借助電子鼻測定分析,通過線性判別分析法(LDA)進行氣味信息的分析和判斷,利用Alphasoft分析軟件對奶樣進行貨架期預測,得到空白樣和對照樣的預測貨架期天數分別是5d和7d,說明脈沖強光滅菌技術可以有效延長巴氏奶的貨架期。

巴氏奶,滅菌,貨架期,電子鼻,脈沖強光

牛奶在生產加工及貯藏過程中存在很多安全隱患,由于微生物的污染導致牛奶快速腐敗變質、貨架期縮短、乳及乳制品品質下降等諸多問題一直困擾著人們。基于目前牛奶保鮮技術存在種種不足,諸如超高壓殺菌技術、臭氧滅菌技術、紫外線消毒技術等冷滅菌技術倍受關注,其滅菌溫度低,既利于保持食品中功能成分的生理活性,又有利于保持其色、香、味及營養成分。

脈沖強光技術是近年來逐步發展起來的一種新型非熱滅菌技術[1],該技術作為表面滅菌具有強度高、耗能低、瞬時性等特點能夠破壞多種微生物,廣泛應用于水處理、空氣滅菌、食品加工、制藥、乳制品等眾多領域,避免了傳統熱滅菌對熱敏性活性物質的破壞和化學滅菌帶來的食品安全隱患[2-3]。目前還沒有相關文獻關于脈沖強光對巴氏奶霉菌滅菌效果的研究,本實驗研究脈沖強光對巴氏奶霉菌的滅菌效果,為有效控制鮮牛奶加工及產品儲藏過程中霉菌污染,提高產品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏奶 沈陽輝山乳業有限公司;孟加拉紅培養基 北京奧博星生物有限公司。

AR224CN電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;BPS-100CA恒溫生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;EC2菌落計數分析儀 法國生物梅里埃集團;HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市鑫鑫實驗儀器廠;MiniMix400W拍打均質器 法國Interscience公司;Pen3電子鼻 德國Airsense公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;YXQ-LS-75S11立式全自動壓力滅菌鍋 北京科創百萬科技發展有限公司;ZWB-I-01(LA50-800A)脈沖強光滅菌實驗柜 寧波中物光電滅菌技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 巴氏奶處理方法 分別吸取5、10、15、20、25mL的巴氏奶待測液于五個無菌培養皿中,用傾倒法對巴氏奶樣品進行處理。

1.2.2 脈沖強光閃照處理 實驗參數設定為:(1)閃照距離13cm、閃照能量300J、樣液厚度2mm的相同條件下,閃照次數為:10、20、30、40、50 次;(2)在閃照次數30 次、閃照能量300J、樣液厚度2mm的相同條件下,閃照距離為:12、13、14、15、16cm;(3)在閃照次數30次、閃照距離13cm、樣液厚度2mm的相同條件下,閃照能量為:100、200、300、400、500J;(4)在閃照次數30次、閃照距離13cm、閃照能量300J的相同條件下,樣液厚度為:1、2、3、4、5mm。設計以閃照能量、閃照距離、閃照次數、樣液厚度為四個單因素的實驗,研究脈沖強光對處理的巴氏奶的霉菌滅菌效果的影響。

1.2.3 微生物檢驗 將脈沖強光處理前和處理后的兩種不同樣品,參照GB 4789.15-2010《食品微生物檢驗 霉菌和酵母計數》[4],用菌落計數儀計算霉菌菌落數,做兩次重復取平均值。霉菌滅菌率的計算公式:

滅菌率(%)=[(初始菌落數-處理菌落數)/初始菌落數]×100

1.2.4 優化實驗條件和驗證 選擇閃照能量(J)、閃照距離(cm)、閃照次數(次)和樣液厚度(mm)四個單因素的實驗結果,分別用A、B、C、D表示,以巴氏奶霉菌的滅菌率(%)為響應值(Y)[5-7],以上述四個單因素為自變量設計響應面實驗設計。根據Box-Behnken中心組合設計原理,利用Design Expert 8.0.6軟件分析數據,篩選脈沖強光對巴氏奶霉菌滅菌效果的最佳實驗條件,設計響應面實驗三水平四因素表如表1所示。

1.2.5 電子鼻測定方法 分別將經過脈沖強光處理對照樣和未經脈沖強光處理空白樣各20mL奶樣置于50mL燒杯中用保鮮膜封口,在常溫下放置20min。待樣品揮發性物質揮發達到平衡后,采用頂空抽樣的方法對其進行測量,每個樣品平行測定3次。

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

電子鼻測定參數:進氣量360mL/min,檢測時間為40s,清洗時間為90s[8]。電子鼻系統自動記錄樣品的處理數據,保存后重新換上保鮮膜于冰箱內保存,每隔24h檢測一次,持續8d。

1.2.6 數據處理 采用SAS8.0對實驗數據進行線性判別式分析法(Linear Discriminant Analysis,LDA)。LDA是一種常用的模式分類方法,根據統計學原理,假定判別函數Y是樣品X的線性函數,每一類樣品形成一個判別函數,尋找未知樣品在最大判別函數值的類別中的位置[9]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 閃照次數對霉菌滅菌率的影響 五種層次照射次數對巴氏奶霉菌的滅菌效果如圖1所示。以相同的閃照能量、閃照距離和樣液厚度為前提,探究不同閃照次數與霉菌滅菌程度的差異。圖1中,霉菌的滅菌率隨著閃照次數的增加而逐漸走高,兩者正相關。閃照次數在10～20次層次之間,霉菌的滅菌率的增幅坡度較陡。達到30次時,曲線出現了第一個峰值,成為霉菌滅菌率的首個最高值。閃照次數在30次以后霉菌的滅菌率變化不明顯,上升幅度緩慢。說明30次的閃照次數能達到明顯的滅菌效果,隨著相應的閃照次數的增加,脈沖強光設備的損壞程度和能量的損耗也有所增大,最終選擇30次為巴氏奶最佳的霉菌滅菌次數。

圖1 閃照次數對霉菌滅菌率的影響Fig.1 Influence of flash times on disinfection rate of mould

2.1.2 閃照距離對滅菌率的影響 如圖2所示,脈沖強光的閃照距離與霉菌的滅菌率呈負相關,滅菌率隨著閃照距離的增加而逐漸減少,江天寶等人[10-11]的研究表明殘存的活菌數會隨著閃照距離的增大而增加,與本實驗研究的結果相同。閃照距離在12cm時滅菌效果最好,而在16cm時滅菌效果最差,最終選擇12cm作為最佳。

圖2 閃照距離對霉菌滅菌率的影響Fig.2 Influence of flash distance on disinfection rate of mould

2.1.3 閃照能量對滅菌率的影響 圖3中,從100J到300J閃照能量范圍內,霉菌的滅菌率逐漸增大,由70.98%遞增到98.77%,此區間內的滅菌效果持續保持明顯狀態。閃照能量增長到300J以上時,滅菌效果較為穩定,上升幅度緩慢,說明在300J的能量強度照射下,霉菌細胞受到了很大的破壞。

圖3 閃照能量對霉菌滅菌率的影響Fig.3 Influence of flash energy on disinfection rate of mould

2.1.4 樣液厚度對滅菌率的影響 圖4中,樣液厚度與霉菌滅菌率呈負相關,樣液厚度增加,滅菌率效果隨之降低,1mm處的樣液厚度存在最大滅菌率為97.78%。之所以單因素選擇樣液厚度為2mm而不是1mm為最佳條件是因為兩者殺菌效果相差甚微,且樣液厚度越大,處理量越大,提高了處理效率。

圖4 樣液厚度對霉菌滅菌率的影響Fig.4 Influence of liquid sample thickness on disinfection rate of mould

2.2 響應面法滅菌條件的優化

2.2.1 響應面實驗設計及結果 采用Design-Expert 8.0.6軟件回歸分析實驗數據,獲得回歸方程,尋找獲得最大滅菌率的二次多項回歸方程[12-13]。有關閃照次數(A)、閃照距離(B)、閃照能量(C)及樣液厚度(D)四個水平的二次多項回歸方程如下:Y=99.80-0.094A+0.086B+0.13C+0.41D+6.13AB+3.82AC-3.73AD+4.06BC-3.11BD+5.81CD-7.85A2-2.72B2-6.24C2-5.99D2。

表2 Box-Behnken 實驗設計及結果Table 2 Results of response surface experiments

表3中回歸模型極顯著(p<0.0001),失擬項不顯著(p=0.1372>0.05),模型的失擬項表現為不顯著,說明該模型建立的有意義且擬合關系良好。模型相關系數R2=0.9585,表明此回歸模型三水平四因素的回歸分析合理,四因素與Y之間有良好的線性關系,可替代性好,可用于實驗結果的分析,對選取最佳工藝條件的優化預測有很高的可信度[14-16]。在此回歸模型中,一次項C和D均達到了極顯著水平(p<0.0001),閃照次數A的影響顯著(0.010.05)。由表中p值項可知,

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

注:**表示差異極顯著(p<0.01),*表示顯著(0.01

閃照次數(A)、閃照距離(B)、閃照能量(C)和樣液厚度(D)對霉菌滅菌率影響大小依次排序為D>C>A>B。二次項A2、B2、C2和D2以及交互項AB、AD、CD顯示極顯著影響,交互項BD影響顯著,而交互項閃照次數A、閃照能量C和閃照距離B、閃照能量C影響不顯著,此現象表明實驗選定的四種單因素影響因子對霉菌的影響不是單一的線性關系[13]。

2.2.2 各因素之間的交互作用 見圖5～圖7。

圖5 閃照次數和閃照能量對霉菌滅菌率的響應面圖Fig.5 Response surface of flash times and flash energy on the disinfection rate of mould

圖6 樣液厚度和閃照能量對霉菌滅菌率的響應面圖Fig.6 Response surface of liquid sample thickness and flash energy on the disinfection rate of mould

圖7 樣液厚度和閃照次數對霉菌滅菌率的響應面圖Fig.7 Response surface of liquid sample thickness and flash times on the disinfection rate of mould

利用二次多項式回歸方程一階偏導,通過Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型分析,篩選出最佳實驗參數:A=35.3,B=12.13,C=280.1,D=2.11。即閃照次數35.3次、閃照距離12.13cm、閃照能量280J、樣液厚度2.11mm,但考慮到實際生產條件,乳及乳制品微生物安全標準以及脈沖強光滅菌安全柜裝置的設置情況,將此最佳工藝條件修正為:閃照次數35次、閃照距離12.8cm、閃照能量300J、樣液厚度2mm。此參數條件下重復3次實驗驗證,巴氏奶霉菌的滅菌率平均值達到了99.97%,實驗值與預測值接近,符合對實驗參數的預測,該響應面分析模型可用作脈沖強光對巴氏奶霉菌滅菌條件的優化。

2.3 應用電子鼻對脈沖強光處理前后牛奶貨架期的預測

2.3.1 線性判別分析法(LDA) 從圖8中可以看出,LDA判別的兩個主成分的總貢獻率為94.839%,組內信息點非常集中,各個氣味特征區分效果好,是因為LDA判別了各類間的差異并將其最大化,更加準確的判斷出氣味間的差別[17-18]。圖8是空白樣品第一天貨架期的主成分分析圖譜,前5d的牛奶氣味范圍區分明顯,說明未經處理的牛奶1～5d的氣味特征范圍較大。但第6～8d氣味圖譜有重疊,此空白樣的LDA判別結果為第6d開始,空白樣的氣味特征范圍開始模糊,奶樣的狀態也變得粘稠,顏色略微變黃,說明其氣味相似且變化小。在圖9中,各個氣味特征判別較為明顯,兩個個判別主成分貢獻率分別是91.02%和6.4108%,總和超過了85%,區分效果非常明顯。說明6d以后的奶樣氣味特征范圍較為接近,特征值相似,電子鼻不能有效地區分各種氣味成分。

圖8 空白樣的LDA分析圖Fig.8 LDA analysis of Blank samples

圖9 對照樣的LDA分析圖Fig.9 LDA analysis of control sample

2.3.2 貨架期分析 利用Alphasoft分析軟件對經過不同滅菌處理的巴氏奶的氣味信息進行貨架期分析。相同條件下,以存放時間為橫坐標,以不同保存時間的空白樣和對照樣牛奶檢測的傳感器響應值相對差值作為縱坐標,繪制氣味變化分析曲線。將第一次氣味信息作為基準值,若隨著保存時間的延長氣味強度減弱,則曲線呈下降趨勢,分析值為負數,反之則曲線上升,分析值為正數。

從圖10可知,隨著保存時間的延長,牛奶的氣味變化基本呈下降趨勢,說明隨著牛奶保存天數的延長,傳感器對牛奶的氣味的捕捉能力逐漸減弱,牛奶的氣味強度逐漸降低。在第6d和第8d兩者分別達到了氣味的突變點,與LDA的分析結果基本一致。因此,脈沖強光對巴氏奶處理前后的貨架期分別是5d和7d。

圖10 空白樣和對照樣的分析圖Fig.10 Alphasoft analysis chart of blank samples and control samples

3 結論

本研究通過單因素實驗和Box-Behnken中心組合設計原理和響應面分析法對滅菌工藝進行優化,擬合了閃照次數、閃照能量、閃照距離和樣液厚度這四個因素對滅菌率的回歸模型,經檢驗證明該模型合理可靠。由該模型確定的最優工藝條件為閃照次數35 次,閃照距離12.8cm,閃照能量300J和樣液厚度2mm,霉菌的滅菌率達到99.97%。通過模型系數顯著性檢驗,得到因素的主效應關系為:樣液厚度>閃照能量>閃照次數>閃照距離。

利用電子鼻對脈沖強光閃照前后的巴氏奶進行貨架期的分析和預測,主要通過線性判別分析法(LDA)對兩組奶樣進行氣味信息的分析和判斷,LDA的累積總貢獻率為94.839%,說明此方法適用于巴氏奶氣味特征的檢測分析。利用Alphasoft分析軟件對兩組奶樣進行貨架期預測,得到脈沖強光處理前后巴氏奶樣品的貨架期分別是5d和7d,由此證明脈沖強光滅菌技術可以有效地延長巴氏奶的貨架期。

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Optimization of extraction conditions of pulsed light parameters forenhanced sterilization of mould on pasteurized milkby response surface methodology

WANG Bo,ZHU Li-jie,HUI Li-juan,LIU He,MA Tao*

(College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Grain andOil Science and Technology Institute of Bohai University,Jinzhou 121013,China)

To study the sterilization effect of the pulsed light sterilization technology to the pasteurized milk,pasteurized milk as the research object,with the sterilization rate of mould as a measure indicator. Four extraction parameters including flash times,flash distance,flash energy and samples liquid thickness were optimized using central composite design and response surface methodology based on single factor investigation for achieving maximum the sterilization rate of mould. Using Box-benhnken central composite design and response surface analysis theory,the optimum extraction condition for flash times of 20,flash distance of 12.8cm,flash energy of 300J and samples liquid thickness of 2mm. Under these conditions,the sterilization rate of mould was 99.97%. By means of electronic nose analysis and determination. Odor information of two milk sample were analyzied and judged by linear discriminant analysis(LDA). Using the Alphasoft software,it was found that the shelf life of milk sample were 5d and 7d before and after pulsed light treatment. Plused light sterilization technology can extend the shelf life of pasteurized milk effectively.

pasteurized milk;sterilization;shelf life;electronic nose;pulsed light

2014-11-24

王勃(1986-)，男，碩士，實驗員，研究方向：糧油工程。

*通訊作者:馬濤(1962-)，男，博士，教授，研究方向：糧油工程。

TS252.2

B

1002-0306(2015)13-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.045