基于分光光度法構建納豆激酶纖溶活性快速測定方法

聶光軍,趙 銳,岳文瑾,楊超英,薛正蓮,魏 明,溫東升,聶智杰,葉裕超

(安徽工程大學,生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

基于分光光度法構建納豆激酶纖溶活性快速測定方法

聶光軍,趙 銳,岳文瑾*,楊超英,薛正蓮,魏 明,溫東升,聶智杰,葉裕超

(安徽工程大學,生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

為建立一種快捷、有效的納豆激酶纖溶活性測定方法,在研究纖維蛋白平板法的基礎上,構建了以透明圈面積為中間參數的納豆激酶纖溶活力與吸光度值之間關系模型,通過測定納豆激酶顯色反應中的吸光度值,直接獲得納豆激酶的纖溶活性。結果顯示改進后的酪蛋白方法可行,其模型方程為y=1877.77x-481.08(R2=0.9924)。驗證結果顯示模型相關性強,準確度較高,操作簡便、快速、檢測成本低,是一種高效的納豆激酶纖溶活性快速檢測方法。

納豆激酶,纖維蛋白平板法,酪蛋白法,TAME法

納豆激酶(Nattokinase,NK)由枯草桿菌產生的絲氨酸蛋白酶,具有優良的溶栓效果,能降低血粘度,改善血液循環等作用,對高血壓、衰老、中風、肌肉痙攣和心腦血管疾病也有很好的療效[1-2]。相對于傳統藥劑,NK分子量小,安全高效,作用時間長[3],不僅能抑制血栓形成,而且溶栓作用強,并抗胰酶水解,在腸道內穩定性好,易被人體消化吸收,因而既可以靜脈給藥,也可以口服[4]。因此,NK有望成為新型溶栓藥物制劑[5]和功能性食品添加劑[6],其相關產品(如納豆)也將成為重要的保健食品或飲品。

目前,困擾NK研究的主要問題之一是其纖溶活性檢測方法。經典的NK纖溶活性測定方法是纖維蛋白平板法。該方法測定結果比較直觀,但由于所用試劑為生物制品,批次差異大且昂貴,實驗操作復雜,實驗過程耗時,難以進行大批量樣品高通量篩選[7]。其他常用的方法有四肽底物法[8]、血清板法[9]、甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(Na-P-Tosyl-L-arginine methylester hydrochloride,TAME)法[10]、酪蛋白法[11]等。其中,TAME法和酪蛋白法基于顯色原理,利用分光光度法進行檢測,相對于經典的纖維蛋白平板法,上述兩種方法具有靈敏度高、操作簡單、檢測成本低廉等優點;但是,它們表征的NK活力并非纖溶活性。因此,為高效檢測NK的纖溶活性,建立纖維蛋白平板法與TAME法和酪蛋白法的關聯十分必要。

本研究通過研究纖維蛋白法,并在此基礎上建立以透明圈面積為中間參數的纖溶活性與吸光度值之間的關系模型,嘗試構建一種更為有效、快捷的NK纖溶活性測定方法,提高NK纖溶活性的檢測效率,降低其檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆激酶,本實驗室自制(所用菌種為枯草納豆桿菌 購自中國工業微生物菌種保藏中心和從市售納豆菌粉中分離所得);TAME Sigma公司;尿激酶標準品(1280IU/支)、纖維蛋白原(98mg/支)和凝血酶(190bp/支) 中國藥物生物制品檢定所;瓊脂糖和福林酚試劑 國藥集團化學試劑有限公司;酪蛋白 南京化學試劑一廠。

紫外分光光度計(SP-754) 上海光譜儀器有限公司;隔水式恒溫培養箱(GNP-050)常州普天儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(TGL-16G) 上海安亭科學儀器廠;數顯恒溫水浴鍋(HH-6) 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 纖維蛋白平板法

1.2.1.1 纖維蛋白平板的制備 基于馬恩平等[12]報道的方法,向10mL 2%的瓊脂糖溶液中添加1mL濃度為1bp/mL凝血酶溶液,混勻后,立即加入10mL 3%是纖維蛋白原溶液,迅速搖勻并快速倒入直徑為9cm的培養皿中,室溫下放置1h,再用孔徑為0.5cm的打孔器打孔備用。

1.2.1.2 標準曲線制作及酶活測定 用微量移液器分別將10μL纖溶活力為20、40、60、80、100、150、200、300、400U/mL的尿激酶加入已制備好的纖維蛋白平板的點樣孔中;室溫放置10min后,再倒置于37℃恒溫培養箱中培養18h;利用游標卡尺檢測透明圈直徑(cm),并根據公式S=π(r+0.5)(r-0.5)計算透明圈面積(r為半徑),并以此和已知的活力為橫縱坐標,通過直線擬合得標準曲線方程:y=45.495x(R2=0.9906)。等量的未知樣品可通過上述相同步驟得出透明圈面積后,根據尿激酶標準曲線計算出未知樣品的纖溶活性。

1.2.2 酪蛋白法 NK為堿性蛋白酶,可降解酪蛋白為酪氨酸,酪氨酸與酚試劑反應生成藍色化合物,在680nm處有最大吸收峰,其A680nm與NK活力呈正相關。可利用分光光度計測定其A680nm,并計算NK的纖溶活性,檢測耗時約為1h。基于魏華等[11]報道的方法設計具體步驟如下:分別將2mL 0.5%酪蛋白溶液和1mL酶樣品放置于30℃水浴中預熱5min,然后將二者充分混勻后,置于30℃水浴中反應10min后,取出并立即加入3mL 10%三氯乙酸溶液,混勻后放置10min,濾紙過濾。同時另作一組對照,取酶液1mL先加3mL 10%三氯乙酸,再加2mL 0.5%酪蛋白溶液,30℃溫浴10min,放置15min后過濾;取3支試管并編號,分別加入上述樣品濾液、對照濾液和水各1mL;再向各試管中加入5mL 0.55mol/L碳酸鈉混勻后再各加入酚試劑1mL,立即混勻,30℃顯色15min;以加水的一管為空白,應用分光光度計分別檢測樣品和對照的A680nm,得A樣和A對,由此計算得ΔA680nm(A樣-A對),該ΔA680nm與NK的活力呈正相關。

1.2.3 TAME法 NK對精氨酸羧端肽有較強的切割作用。37℃下,NK可將TAME切割成對甲基苯磺酰-L-精氨酸和甲醇;高錳酸鉀可將甲醇氧化成甲醛,甲醛與變色酸在沸水浴中發生顯色反應,574nm處有最大吸收峰,A574nm與NK活性成正相關。應用分光度計檢測A574nm,并計算NK的活性。基于熊迎新等報道的方法[13],設計具體步驟如下:取具塞試管若干支,分別加入0.1mL 0.1mol/L TAME、pH8的磷酸鹽緩沖液0.1mL,NK樣品0.1mL(對照管樣品為加熱失活后的NK樣品),37℃水浴30min,取出后立即冰浴,同時加入0.2mL 15%三氯醋酸終止反應,然后,加入0.1mL 2%高錳酸鉀后振搖2min,使其充分反應,再加入0.1mL 10%亞硫酸鈉,最后加人4mL變色酸充分振搖混勻,放入沸水浴中顯色反應25min,取出后冷水浴冷卻,測定其ΔA574nm。

1.3 反應時間和酶活范圍的影響

應用纖維蛋白平板法檢測NK的纖溶活性,以不同活力的尿激酶(20～400IU/mL)為研究對象,將上述等量不同活力的尿激酶點樣于纖維蛋白平板中,37℃下分別孵育6～21h,測其透明圈面積,再分別以透明圈面積和已知的活力為橫縱坐標,直線擬合不同反應時間和不同活力范圍的實驗散點得標準曲線方程的相關系數(R2)和斜率(Slope)。比較方程的R2和斜率,分析不同反應時間和酶活范圍對纖維蛋白平板法測定效果的影響。

1.4 模型建立及驗證

1.4.1 模型建立 選擇實驗室制備的原始纖溶活力為1668IU/mL(該活力由纖維蛋白平板法測定)的NK為實驗樣品,分別將其稀釋5、6、7、8倍,并編號為C05～C08。依次應用酪蛋白法和TAME法測定相應的ΔA680nm和ΔA574nm,分別以ΔA680nm、ΔA574nm和已知纖溶酶活為橫縱坐標,通過直線擬合得出NK ΔA680nm、ΔA574nm與其纖溶活力間的線性模型。

1.4.2 模型驗證 應用不同發酵批次和不同菌株發酵的NK粗酶液驗證模型的準確度和適用性。具體如下:應用購自中國工業微生物菌種保藏中心枯草納豆桿菌以市售黃豆為基質進行固體發酵15、18、21h后,以固液比1∶4的生理鹽水洗脫發酵后的固體基質,震蕩浸提得不同批次的NK樣品,分別編號為S1、S2和S3。再以市售納豆菌粉分離到的納豆桿菌發酵24h,通過相同的方法制備出不同菌株發酵生產的NK樣品S4。分別應用纖維蛋白平板法、酪蛋白法和TAME法檢測S1、S2、S3和S4的纖溶活性(A1)、ΔA680nm、ΔA574nm,分別利用已建立的模型計算出纖溶活性模型估計值(A2),再應用SPSS 10.0 軟件進行T檢驗和相關性分析A1和A2兩組值,驗證已建模型的準確度和適用性。

1.5 數據處理

所有實驗為三個重復,以算術平均數表示實驗結果。

2 結果與分析

2.1 纖維蛋白平板法的研究

為深入了解纖維蛋白平板法檢測NK纖溶活性的準確度,分析以透明圈面積和已知纖溶活力為橫縱坐標的標準曲線斜率和相關系數隨孵育時間的變化規律。結果顯示,斜率隨孵育時間增加而降低,相關系數隨孵育時間增加而增加,兩者都在18h后達到平衡(圖1)。結果表明孵育時間顯著影響該測定方法的準確度,即孵育時間越長,測定準確度越高;孵育時間達到18h后,準確度最高。這可能是因為酶樣品在凝膠介質中的擴散速度有關,也證明了纖維平板制備的均一程度和酶樣品純度對測定結果的準備度存在顯著的影響。這表明了纖維蛋白平板法不僅測定周期長,而且隨機誤差大。此外,在實際測量過程中,孵育時間過長,人工血栓會自然解聚,即當孵育時間超過15h后,透明圈變得模糊而觀測不清,進而導致測定誤差顯著增大[14]。為此,構建一個有效、快捷的NK纖溶活性測定方法十分必要。

圖1 不同孵育時間對模型斜率和相關系數(R2)的影響Fig.1 Effect of the slope on the correlation coefficient

為了解樣品濃度范圍對測定方法的影響,依次以20～80、100～400、20～400U/mL三個濃度范圍的尿激酶為樣品,分析檢測活性與已知纖溶活性間的相關系數(圖2),結果發現上述三個濃度范圍內的相關系數依次為0.9958、0.9902和0.9906。結果表明樣品濃度越低檢測的準確度越高,樣品濃度范圍越窄檢測的準確度也越高。這可能是因為樣品濃度越高,需要的擴散時間越長,透明圈變得越模糊,隨機誤差增加;另外,濃度差異越大,所需的擴散時間跨度也就越大,隨機誤差會隨之相對增加。

圖2 不同樣品濃度范圍的擬合曲線Fig.2 The fitting curve of enzyme activity against the size of transparent circle注:a:20～80IU/mL;b:100～400IU/mL;c:20～400IU/mL。

2.2 纖維蛋白平板法-酪蛋白法

以平板法的溶圈面積作為中間參數,構建酪蛋白法的吸光值(ΔA680nm)與尿激酶的纖溶活性單位數的關系(圖3),兩者呈良好的正相關。線性回歸方程為:y=1877.77x-481.08(R2=0.9924)。為驗證該模型測定NK纖溶活性的準確度和適用性,選擇不同發酵批次(相同菌株發酵)和不同菌株發酵的NK粗酶液為樣品,分別應用纖維蛋白平板法和酪蛋白法檢測,結果如表1所示。應用SPSS軟件對A1和A2兩組值進行配對樣品T檢驗得:t值為0.989(>0.05),表明兩組值差異不顯著。相關性檢驗發現其相關系數為0.929,接近0.05的顯著性水平,表明具有較強的相關性。其中,在測定同一菌株不同發酵批次的NK樣品時,準確度明顯高于不同菌株發酵的NK樣品。由此推斷由同一菌株發酵產生的NK粗品,其中含有的雜質對酶纖溶活性測定影響不明顯,而由不同菌株發酵產生的NK粗品可能因為菌株發酵特征不同導致發酵液中的雜質變化差異較大,進而影響酶纖溶活性的準確度。針對這種情況,可以通過重新構建關系模型來規避由不同菌株發酵導致的雜質誤差影響過大的問題。綜上,可以認定改進后的酪蛋白法可用于測定NK的纖溶活性。

圖3 納豆激酶吸光度值與其纖溶活性間的關系曲線Fig.3 The model of nattokinase activity against its absorbance value 注:a:酪蛋白方法;b:TAME法。

表1 納豆激酶ΔA680nm與其纖溶活性關聯模型驗證
Table 1 Verification of the model between the absorbance value(680nm)and the fibrinolytic activity of nattokinase

樣品ΔA680nm斜率截距A2(U/mL)A1(U/mL)S1S2S3S40.4770.4930.4520.5541877481414.6405.5444.6459.9367.6359.1559.2493.7

注:A1:直接應用纖維蛋白平板法檢測得到的NK纖溶活性;A2:應用酪蛋白法檢測,并通過纖維蛋白平板法-酪蛋白法關聯模型計算得到的NK纖溶活性。S1～S3為同一菌株不同批次發酵的NK樣品,S4為不同菌株發酵的NK樣品。

2.3 纖維蛋白平板法-TAME法

以平板法的溶圈面積作為中間參數,構建TAME法吸光值(ΔA574nm)與尿激酶的纖溶活性的關系(圖3b),兩者呈良好的正相關。線性回歸方程為:y=1251.03x+114.76(R2=0.9809)。為驗證該模型的準確度和適用性,選擇不同發酵批次(相同菌株發酵)和不同菌株發酵的NK粗酶液為樣品,分別應用纖維蛋白平板法和TAME法檢測,結果如表2所示。比較A1和A2兩組值發現兩者差異較大(遠大于誤差范圍),可能因為發酵液中的雜質嚴重影響TAME的顯色反應,這一結論與熊迎新等[13]報道的結果一致。由此表明該模型難以適用對NK粗品纖溶活性的檢測。

表2 納豆激酶ΔA574nm與其纖溶活性關聯模型驗證Table 2 Verification of the model between the absorbance value(574nm)and the fibrinolytic activity of nattokinase

注：A1:直接應用纖維蛋白平板法檢測得到的NK纖溶活性;A2:應用TAME法檢測,并通過纖維蛋白平板法TAME法關聯模型計算得到的NK纖溶活性。S1～S3為同一菌株不同批次發酵的NK樣品,S4為不同菌株發酵的NK樣品。

3 結論

經典的納豆激酶纖溶活性單位是以藥典收載的尿激酶為參照的,常用測定方法為纖維蛋白平板法。該方法操作比較繁瑣,耗時長達18h,且通過表觀的溶解圈面積大小定量纖溶活性,檢測誤差大;此外,該方法受樣品純度、平板制備均一程度(不同批次)、孵育時間等影響較大,方法靈敏度低;因纖維蛋白原和凝血酶的高價格導致檢測成本難以降低。因此,纖維蛋白平板法不宜作為一種常規的檢測手段。改進后的酪蛋白法是基于分光光度法進行體外定量測定NK纖溶活性,用時約為1h,大大少于纖維蛋白平板法,具有及時、高效、低成本的優勢,適用于保健食品纖溶活力的體外測定。此外,針對不同的NK的濃度范圍,可構建不同區間的關系模型;針對不同發酵條件,可與纖維蛋白平板法結合使用,有效提升NK纖溶活性的準確度和精密度。因此,改進后的酪蛋白法是一種高效的NK纖溶活性快速檢測方法。

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Construction of a rapid method for assaying the fibrinolytic activityof Nattokinase based on spectrophotometric assay method

NIE Guang-jun,ZHAO Rui,YUE Wen-jin*,YANG Chao-yin,XUE Zheng-lian,WEI Ming,WEN Dong-sheng,NIE Zhi-jie,YE Yu-chao

(College of Biochemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

To construct a rapid,efficient method for assaying the fibrinolytic activity of nattokinase,two models between fibrinolytic activity of nattokinase in fibrin plate method and absorbance value of nattokinase in casein method or in TAME method were formed with the size of transparent zone as an intermediate parameter based on the study on fibrin plate method. The fibrinolytic activity can be directly determined by detecting the absorbance value of nattokinase in casein method or in TAME method. The results showed that the improved casein method can be applied in determining the fibrinolytic activity of nattokinase,the model in the improved method was as the following:y=1877.77x-481.08(R2=0.9924). The result of verification experiment indicated that the model owned such advantages as strong correlation,high degree of accuracy,easy operation,high efficiency,and low cost. Therefore,the improved casein method was an efficient method for real time detecting the fibrinolytic activity of nattokinase.

Nattokinase;fibrin plate method;casein method;TAME method

2014-07-28

聶光軍(1976-)，男，博士，副教授，研究方向：分子生物學。

*通訊作者:岳文瑾(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：生物納米材料。

安徽省自然科學基金(1508085SMC212);安徽省高校自然科學研究重點項目(KJ2014A025)；國家級大學生創新創業訓練計劃(201210363042, 201310363076)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)13-0298-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.054