基于核酸適體微球的沙門氏菌檢測方法研究

金 娜,孔先利,林 敏,左 鵬

(1.溫州出入境檢驗檢疫局,浙江溫州 325000;2.臺州出入境檢驗檢疫局,浙江臺州 318000;3.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237)

基于核酸適體微球的沙門氏菌檢測方法研究

金 娜1,孔先利2,林 敏1,左 鵬3

(1.溫州出入境檢驗檢疫局,浙江溫州 325000;2.臺州出入境檢驗檢疫局,浙江臺州 318000;3.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室,上海 200237)

目的:研究基于核酸適體的微球芯片系統應用于沙門氏菌檢測的可行性。方法:采用偶聯有沙門氏菌適體的微球作為載體,以熒光作為檢測信號建立微球芯片體系,并優化影響檢測結果的各項因素。結果:通過此方法檢測20份水產樣品,6份檢出沙門氏菌,檢出率為30%。結論:建立的檢測體系能實現對沙門氏菌的快速,準確的檢測,且具有較高的特異性。

沙門氏菌,適體,微球,檢測

沙門氏菌(Salmonella)是重要的腸道致病菌,根據抗原成分的不同分成2000多個血清型,我國已發現的血清型有216個[1]。沙門氏菌在港灣環境里可繁殖和生活數周,魚類和貝類由于生活在污水中而遭受沙門氏菌污染[2-4]。人類由于食用了生鮮或未經徹底加熱的水產品而導致食物中毒,臨床表現為惡心、嘔吐、腹瀉、發熱、頭痛,嚴重時引起胃腸炎、敗血癥和其它炎癥,甚至危及生命。世界各國均對水產品中沙門氏菌的污染狀況非常重視,將其列為水產品中不得檢出的致病菌并進行嚴格的檢測和監控。我國對水產品的致病菌檢測中,沙門氏菌被定為必檢項目。相關數據顯示,水產品沙門氏菌的檢出率約為20%[5]。

目前沙門氏菌的主要檢測方法有國標法、ELISA[6-7]、免疫磁珠法[8-10]、PCR[11-13]等。傳統檢測方法包括前增菌、增菌、生化鑒定,以及血清學鑒定等,不僅耗時長,也易發生漏檢;ELISA由于抗原抗體的交叉反應,靈敏度低,很難對致病菌進行準確的檢定,容易造成漏檢,同時抗體的生產、保存以及抗體效價也受到一定條件的限制,這也在一定程度上限制了ELISA方法的應用;PCR技術以其敏感性、特異性、簡單快速的優點,已廣泛應用,但PCR往往需要昂貴的儀器,同時容易非特異性擴增導致假陰性(假陽性);而核酸適體(aptamer)的出現為傳統免疫傳感器的發展開辟了一條新的道路。由于核酸適體的高親和力、高特異性、易合成和標記、易儲存且成本低等優點,現已被廣泛應用于各類目標物質的富集和檢測[14-17],本研究主要以納米微球為載體,利用沙門氏菌與相應適體的特異性結合能力,從而達到對沙門氏菌的檢測。

表1 本實驗中使用的沙門氏菌適體[14]和寡核苷酸序列Table 1 Sequence of salmonella aptamer and oligonucleotides used

注:Ap為氨基修飾的沙門氏菌適體;Cy5-Ap為熒光修飾的沙門氏菌適體;Target A為與沙門氏菌適體等堿基數的經氨基修飾的任意寡核苷酸。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌ATCC15611、副溶血性弧菌ATCC17802、志賀氏菌ATCC29930、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922,以及李斯特菌CICC21633 均由溫州出入境檢驗檢疫局微生物實驗室菌種中心提供；玻璃微珠(平均直徑250μm,密度:2.05g/mL) 購自sigma-aldrich公司；實驗所需各種致病菌的培養基以及配套試劑 均由北京陸橋技術有限責任公司提供；其它化學試劑均為國產分析純 購自溫州金山化學試劑公司;寡核苷酸探針和引物 均為上海生工生物工程技術服務有限公司合成,并經反向高壓液相層析純化。

Gene pix 4000B掃描儀 帶分析軟件GenePix Pro 3.0,美國AXON instruments;全自動微生物鑒定及藥物敏感實驗分析系統 VITEK32,法國梅里埃公司;微量核酸定量儀 ND-1000 Spectrophotometer,美國thermo fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米微球制作方法

1.2.1.1 玻璃微珠的酸洗(微珠表面羥基活化)500mg未經處理的玻璃微珠浸入1mL 6mol/L HCl溶液中,室溫振蕩反應過夜,多遍水洗至中性,110℃ 真空干燥2h。

1.2.1.2 玻璃微珠的硅烷化 將酸洗玻璃微珠浸入2% 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的無水甲苯溶液,室溫下振蕩反應5h,用無水甲苯溶液清洗5次,每次3min;110℃真空干燥至少3h。硅烷化反應后的微珠直接置于室溫下保存。

1.2.2 活性基團的偶聯 在用APTMS硅烷化試劑反應得到氨基硅烷珠后,本文用1,4-苯二異硫氰酸酯(PDITC)偶聯得到異硫氰酸化珠NCS-Beads。

異硫氰酸化珠NCS-Beads的制備：10mg硅烷化處理的玻璃微珠浸泡在500μL 0.2% PDITC/10%吡啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,37℃振蕩反應2h,DMF洗5遍,無水乙醇洗3遍,二氯甲烷洗3遍,室溫真空干燥。

1.2.3 沙門氏菌適體(Ap)在微珠上的固定 2mg異硫氰酸化珠NCS-Beads置于5μmol/L NH2-Ap的0.05mol/L硼酸鈉緩沖液(pH8.5)20μL,37℃振蕩避光反應過夜,用去離子水洗5次,常溫真空干燥。

1.2.4 適體與沙門氏菌在NCS-Beads反應條件的優化 將S.enterica標準菌株用營養肉湯活化(37℃,24h),劃線接種于DHL和BS平板,單菌落以血平板純化后,進行VITEK鑒定,同時挑取血平板純菌落溶于結合緩沖液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L KCl,100mmol/L NaCl,1.0mmol/L MgCl2pH7.4),制得目標菌懸液濃度,加入NCS-Beads-NH2-Ap,室溫反應10min后,吸取上清液后,以結合緩沖液清洗三次后,加入20μL 5μmol/L Cy5標記適體(Cy5-Ap),室溫反應10min后,吸取上清液后,以結合緩沖液清洗三次,常溫真空干燥。將微珠進行掃描。

1.2.4.1 反應時間對沙門氏菌適體固定量的研究 按照1.2.3.1反應過程,選取了8個時間點(4、8、12、18、24、30、36、48、60h)作為研究,觀察適體固定量的變化。

1.2.4.2 特異性研究 適體與S.enterica特異性研究:實驗選取了金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、志賀氏菌和李斯特菌作為對照菌株與沙門氏菌適體進行特異性反應。各菌種標準菌株經肉湯活化后接種選擇性培養基并純化后,制得菌懸液。

S.enterica與寡核苷酸DNA特異性研究:實驗選取了一段堿基數量與適體相同的寡核苷酸序列(Target A),與沙門氏菌進行特異性反應。取適量(2mg)的異硫氰酸化微珠溶于20μL 0.05mmol/L硼酸鈉(pH8.5)緩沖液后加入20μL 5μmmol/L Ap和Target A,37℃振蕩避光反應48h,以去離子水洗5次,常溫真空干燥后加入50μL沙門氏菌菌懸液(濃度0.2MCF),室溫反應10min,以結合緩沖液清洗三次,加入20μL 5μmol/L Cy5標記適體,室溫反應10min,吸取上清液,以結合緩沖液清洗三次,常溫真空干燥。將微珠進行掃描。

1.2.4.3 微珠顆粒數量的影響 本實驗中選取了20、50和100顆微珠研究其微珠數量對其結合力的影響,實驗過程同上。

1.2.4.4 適體與沙門氏菌反應時間的研究 本實驗中選取了5、10、15、20、25、30min六個時間點研究其反應時間長短對其結合力的影響,實驗過程同上。

1.2.4.5 微珠重復性研究 適體與靶標分子結合后,可用洗脫緩沖液(elution buffer)進行洗脫,從而將靶標分子與適體分離,實現NCS-beads-Aptamer的重復利用,本實驗將洗脫下來的NCS-beads-Aptamer進行重復利用反應,觀察其重復利用次數。

1.2.5 樣本測定 樣品處理過程參照《飼料中沙門氏菌的快速檢測方法 PCR 法》(GB/T 28642-2012)和《出口食品沙門氏菌屬檢驗方法》(SN0170-1992),過程如下:取25g樣品于225mL的緩沖蛋白胨水中,37℃培養4h進行預增菌,取10mL預增菌液于100mL四硫磺酸鹽煌綠增菌液中42℃培養20h進行選擇性增菌,取選擇性增菌液1mL于離心管中10000g離心10min,棄上清液,1mL結合緩沖液去離子水懸浮離心10min,棄上清,再以0.2mL結合緩沖液制得樣品菌懸液。

2 結果與討論

2.1 反應時間對沙門氏菌適體固定量的研究

研究表明[15,18],長鏈DNA相對于短鏈DNA需要更長的固定時間,而該研究中DNA固定量對于檢測結果具有很大影響,從理論上來說,固定在微球的DNA量越多,結合的沙門氏菌靶標量越多,從而提高檢測靈敏度。從圖1中可以看出,適體Aptamer的固定量在48h左右趨于穩定,此后隨著時間的延長,其固定量基本沒有變化,說明適體在微珠上的固定量基本趨于飽和狀態。因此本實驗中確定適體Aptamer固定NCS-Beads的反應時間為48h。

圖1 反應時間對適體固定量的影響Fig.1 Effect of immobilization time of binding amount aptamer onto NCS beads

2.2 特異性研究

S.enterica與寡核苷酸DNA特異性研究：從圖2信號值可以看出,適體Aptamer與沙門氏菌的特異性很好,與其他的致病菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和副溶血性弧菌)基本不發生反應,圖3中等堿基數的任意DNA寡核苷酸鏈與沙門氏菌之間也不發生反應,說明該適體與沙門氏菌的特異性較好,而且適體合成簡單方便,這也是未來適體代替抗體的一大優勢。

圖2 不同標準菌株與適體特異性研究Fig.2 Selectivity of salmonella towards different bacteriums

圖3 DNA寡核苷酸與沙門氏菌特異性研究Fig.3 Selectivity of aptamer towards target B

2. 3 微珠顆粒數量的影響

理論上來說,微珠數量越多,固定適體量相應增加,同時可以加強沙門氏菌檢測靈敏度。但是DNA適體和沙門氏菌反應本身結構變化目前還未有詳細研究,DNA的固定化密度過大,會由于空間位阻[19]和DNA片段上帶電磷酸基團之間的靜電排斥作用等原因[20],使反應特異性降低;密度過小,則會使雜交的量減小,靈敏度降低。因此,DNA的固定化密度是研究DNA固定的重要內容之一。從圖4中可以看出,隨著微珠顆粒數目增加至50個時,熒光值達到一個較高值,而當微珠數量繼續增加至100顆時,信號值反而下降,說明隨著微珠顆粒數的增加,固定適體量的增加可能導致了DNA的空間位阻,最終影響信號DNA分子的結合。

圖4 微珠顆粒數量對熒光信號值的影響Fig.4 Effect of different bead number on fluorescence intensity

2. 4 適體與沙門氏菌反應時間的研究

由于適體與靶標分子的結合力相對于抗原抗體反應更強,適體與靶標分子的結合常數Kd通常為nmol/L級[21],因此反應相對于抗原抗體而言更快速,且通常于室溫條件進行,從圖5中可以看出,適體與靶標分子的反應在15min基本已經達到平衡狀態,隨著時間的延長,沙門氏菌的結合率反而下降,導致最終熒光信號值的降低,因此本研究選取最適合的反應時間為15min。

2.5 微珠重復性研究

從圖6中可以得知,固定了Ap的微球在重復利用5次后,信號值可達到原始值的70%左右,對于檢測完全符合要求,可以達到二次利用的目的。說明適體在微球上的共價作用結合的比較穩定,而隨著重復次數達到7次或更多時,熒光信號值基本只剩下原始值的20%左右,此時已不適合作為檢測載體,從環保經濟的角度,本實驗將微球的重復利用次數確定為5次。

圖5 反應時間對熒光信號值的影響Fig.5 Effect of reaction time on fluorescence intensity

圖6 微珠重復性研究Fig.6 The repetition of NCS-beads

2.6 樣本的測定

對20例水產實際樣本以建立的微球芯片分析系統進行了檢測,同時以GB4789.4-2010作為比較參照,兩種方法的陽性符合率為100%,其中沙門氏菌陽性(6例)符合率為100%,陰性符合率為100%,該分析系統能夠有效對沙門氏菌進行快速檢測,檢測時間比傳統檢測方法5d(數據未給出)縮短至2d。

3 結論

隨著適體研究的廣泛發展與其相對應的適體傳感器有望得到更深入與快速的發展,為生命科學研究中核酸與其它生物分子間的相互作用提供更多的分析方法。此外也為臨床診斷和環境檢測等領域提供更先進的測試工具,為核酸傳感技術與方法的研究與應用注入新的活力。

本文以250μm的玻璃微珠作為固定適體DNA的載體,與沙門氏菌特異性結合后,以熒光標記的適體進行信號輸出,研究了反應過程中適體固定時間,適體與沙門氏菌的特異性,微珠顆粒數以及重復性各項因素的影響,最終建立了一種快速簡便的方法實現了對沙門氏菌的檢測,該方法檢測時間比傳統方法縮短了3d。 同時隨著篩選得到的致病菌和病毒的適體越來越多,該項技術可以應用到更多的致病菌檢測系統中,達到快速而有效的檢測目的,同時可以考慮在微珠上同時固定兩種或其以上的適體探針,以期達到多元檢測的目的。

[1]Collette F,Rachel S,Linda L G,et al.Molecular analysis of the rfbO antigen gene cluster ofSalmonellaenterica serogroup O:6,14 and development of a serogroup-specific PCR assay[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69(10):6099-6015.

[2]范放,洪小柳,趙芳,等.進口冷凍肉類沙門氏菌快速檢驗方法的研究[J].檢驗檢疫學刊,2009(1):45-48.

[3]劉曉霞. 關于食品中沙門氏菌快速檢測方法的新進展[J].化學工程與裝備,2009(10):133-134.

[4]江為民,肖光明. 關于我國水產品質量安全問題及應對措施[J].內陸水產,2008(1):7-10.

[5]林濤,蘭敏,黃偉，等.熒光酶免疫分析儀-微生物鑒定儀在水產品沙門氏菌檢測中的應用[J].食品與發酵工業，2008,34(8):133.

[6]王毳,閏磊,曾慶祝.沙門氏菌的檢測技術與方法[J].現代食品科技,2007,23(5):82-85.

[7]王福厚,霍貴成,主德國,等. 食品中沙門氏菌檢測方法的研究進展[J].中國乳品工業,2009(10):38-41.

[8]余曉峰,張萍,宗凱,等.免疫磁珠法檢測脫水蒜制品中沙門氏菌[J].食品科學,2012,33(24):257-259.

[9]許學斌,顧寶科,金匯明,等.免疫磁珠法檢測食品中的沙門氏菌及分離菌株的耐藥性[J].中國食品衛生雜志,2006,18(3):202-204.

[10]山珊,牛瑞江,等.免疫磁珠法富集沙門氏菌的優化及應用[J].食品工業科技,2013,34(13):153-156.

[11]Sheng-Quan Jin,Bin-Cheng Yin,Bang-Ce Ye.Multiplexed Bead-Based Mesofluidic System for Detection of Food-Borne Pathogenic Bacteria[J]. Applied and environmental microbiology,2009,75(21):6647-6654.

[12]Wolffs PF,Glencross K,Thibaudeau R,et al. Direct quantitation and detection ofsalmonellain biological samples without enrichment,using two-step filtration and real-time PCR[J]. Appl. Environ.Microbiol,2006,72:3896-3900.

[13]Wang L.,P. C. H. Li. Flexible microarray construction and fast DNA hybridization conducted on a microfluidic chip for greenhouse plant fungal pathogen detection[J]. J. Agric. Food Chem,2007,55:10509-10516.

[14]R.Joshi,H.Janagama,H.P.Dwivedi. Selection,characterization,and application of DNA aptamers for the capture and detection ofSalmonellaenterica serovars[J].Mol.cell.Probes,2009,23:20-28.

[15]Gioi Dong Huy,Na Jin,Bin-Cheng Yin,et al. A novel separation and enrichment method of 17b-estradiol using aptamer-anchored microbeads[J]. Bioprocess and Biosystens Engineering,2011,34(2):189-195.

[16]Ma X,Jiang Y,Jia F,et al. An aptamer-based electrochemical biosensor for the detection ofsalmonella[J].J Microbiol Methods,2014,3:94-98.

[17]Wenhe Wu,Jun Li,et al.Gold nanoparticle-based enzyme-linked antibody-aptamer sanwich assay for detection ofSalmonellatyphimurium[J].ACS Appl mater interfaces,2014,6(19):16974-16981.

[18]Han Sheng,Bang-Ce Ye. Different strategies of covalent attachment of oligonucleotide probe onto glass beads and the hybridization properties[J]. Appl Biochem Biotechnol,2009,152:54-65.

[19]Alexander WP,Lauren KW,Rosina MG. Hybridization of mismatched or partially matched DNA at surfaces[J]. J AM CHEM SOC,2002,124:14601-14607.

[20]Nuzzo R G,Fusco F A,Allara D L. Spontuneously organized molecular assemblies(3):preparation and properties of solution adsorbed monolayers of organic disulfides on gold surfaces[J]. J Am Chem Soc,1987,109(8):2358-2361.

[21]Peng Zuo,XiuJun Li,Delfina C,et al.A PDMS/paper/glass hybrid microfluidic biochip integrated with aptamer-functionalized graphene oxide nano-biosensors for one-step multiplexed pathogen detection[J].Lab Chip,2013,13:3921-3928.

Study on detection method ofsalmonellausing aptamer-conjugated microbeads

JIN Na1,KONG Xian-li2,LIN Min1,ZUO Peng3

(1.Wenzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R.C,Wenzhou 325000,China2.Taizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Taizhou 318000,China;3. East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Objective:To investigate the feasibility of aptamer-conjugated microbeads for the detection ofsalmonella. Methods:Amino-terminal aptamer probes were covalently attached onto the surface of microbeads. Fluorescence from microbeads was detected as signal source,and parameters were optimized which may affect detection of the target. Results:Salmonellawere detected in six of 20 aquatic product samples by this method,and the detection rate was 30%. Conclusion:The aptamer-conjugated microbeads can be used for high throughput and accurate detection ofsalmonella.

salmonella;aptamer;microbeads;detection

2014-09-09

金娜(1983-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測。

TS201.1

A

1002-0306(2015)13-0321-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.058