三聚氰胺偶聯抗原制備及其免疫原性分析

趙彭花,張海祥,+,李 濤,王 鑫,宋 衛,劉海靜,謝 毅,霍雪萍,趙向絨,梁導艷,李 元,*,胡 軍,*

(1.陜西省人民醫院中心實驗室,陜西西安 710068;2.陜西省食品藥品檢驗所,陜西西安 710065;3.西安華澳麗康生物工程有限公司,陜西西安 710061)

三聚氰胺偶聯抗原制備及其免疫原性分析

趙彭花1,張海祥1,+,李 濤2,王 鑫1,宋 衛3,劉海靜2,謝 毅1,霍雪萍1,趙向絨1,梁導艷1,李 元1,*,胡 軍1,*

(1.陜西省人民醫院中心實驗室,陜西西安 710068;2.陜西省食品藥品檢驗所,陜西西安 710065;3.西安華澳麗康生物工程有限公司,陜西西安 710061)

探討以2-氯-4,6-二胺-1,3,5-三嗪(CAAT)作為起始物,與6-氨基己酸(ACS)連接轉化得到半抗原Mel-ACS,再將其與牛血清白蛋白(BSA)偶聯形成具有連接手臂的抗原BSA-ACS-Mel,用于單克隆抗體(mAb)制備。經過液相色譜、Western blot及ELISA等抗原特性分析,證明半抗原Mel-ACS的轉化效率達到了85.9%,且針對Mel特異性單抗獲得率達到了42.9%,抗原BSA-ACS-Mel免疫原性較好,完全可以適用于三聚氰胺分子的特異性檢測需要。這對其余小分子抗原的合成也起到一定的指導作用。

三聚氰胺,抗原,單克隆抗體,免疫原性

三聚氰胺(Melamine,Mel),俗稱密胺、蛋白精,IUPAC命名為“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”,分子式C3N6H6,是一種三嗪類含氮雜環有機化合物,它是一種用途廣泛的基本有機化工中間產品[1]。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素,而常規的“凱氏定氮法”檢測食品或飼料中蛋白質含量時都是通過檢測蛋白里面的氮來推算蛋白質含量,不能排除這類“偽蛋白氮”的干擾,因而被一些不法分子利用,以提高其產品中的蛋白質含量。2008年10月,我國制定了乳品中三聚氰胺管理限量值,嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg;含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg[2]。

目前三聚氰胺檢測主要是以氣相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法為主[3-5],這些檢測方法所需設備價格昂貴,儀器操作復雜,檢測人員需受過專業訓練,而且存在適用范圍和使用成本等限制,所以研制特異性強、靈敏度高、操作簡便的三聚氰胺檢測方法是十分必要的。以單克隆抗體為基礎的快速免疫檢測技術具有快速便捷、特異性強、敏感性高等顯著優點[6-7],能夠較好的滿足對三聚氰胺的快速檢測需要,是目前三聚氰胺檢測技術研究的熱點。但是由于三聚氰胺本身分子量較小(MW:126.12),不具免疫原性,無法制備單克隆抗體[8],限制了快速免疫檢測技術的應用。有文獻[9]報道,載體蛋白偶聯帶有6個碳連接手臂的三聚氰胺抗原有利于減少抗原抗體識別時空間位阻作用,更適合做免疫原,但其免疫原性如何,是否可以刺激機體產生特異性抗體？尚未見報道。

因此,在前期相關研究基礎上,本文對三聚氰胺抗原的制備方法進行優化,在偶聯載體與三聚氰胺分子之間加入連接手臂,分析其免疫原性。這不僅對獲得特異的三聚氰胺單抗有重要意義,而且對其它的小分子抗原的制備提供參考思路,具有較高的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三聚氰胺標準品 日本和光純藥業株式會社;2-氯-4,6-二胺-1,3,5-三嗪(CAAT)、2-羧酸-4,6-二胺-1,3,5-三嗪、6-氨基己酸(ACS)、氯金酸、檸檬酸三鈉、三聚氰胺單抗、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠多抗、牛血清白蛋白(BSA)單抗 Sigma公司;BSA Roche公司;鼠源單克隆抗體亞型檢測試劑盒,Imject Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA試劑盒 美國Pierce；其余化學試劑 國藥集團,分析純。

Epoch酶標儀 美國BioTek公司,NanoDrop 2000c蛋白濃度測定儀 美國Thermo公司;HP1200高效液相儀 美國Aglient公司;Quattro Premier質譜 日本Waters公司;DF-1集熱式磁力攪拌器 常州國華電器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;電泳儀 北京市六一儀器廠;752N紫外可見分光光度計 上海精科儀器有限公司;WRS-5A熔點儀 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三聚氰胺偶聯抗原的制備

1.2.1.1 制備無連接手臂的三聚氰胺偶聯抗原(BSA-Mel) 使用Imject Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA試劑盒,連接方法詳見說明書。將2mg的BSA加入200μL的試劑盒連接緩沖液,將1mg EDC溶入超純水100μL中,混勻,室溫反應1h,加0.35mg的三聚氰胺,4℃攪拌,過夜。然后用10mmol/L,pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析除去未反應游離小分子。具體連接過程如圖1所示。

圖1 無連接手臂三聚氰胺偶聯抗原(BSA-Mel)合成示意圖Fig.1 Synthesis route of melamine conjugate antigen(BSA-Mel)

三聚氰胺等小分子化學物質,一般只有反應原性,沒有免疫原性,無法作為抗原直接免疫動物制備單抗。所以,必須將其連接到一些大分子載體蛋白上,形成偶聯物-半抗原,借助大分子T細胞表位間接誘導B細胞激活、分化增殖,產生針對半抗原的特異性抗體[10-11]。而載體蛋白除應具有較好的免疫原性外,還應具有足夠的能反應的側鏈活性基團,以便與抗原連接。相比于卵清蛋白(OVA)每個分子上平均含有20個氨基基團,鑰孔血藍蛋白(KLH)每個分子上平均含有6.9個氨基基團,一個BSA分子上平均含有多達59個氨基基團[12],因此實驗中選擇BSA為抗原的載體蛋白。

為了比較不同的偶聯方式轉化形成抗原的免疫原性,以常見的三聚氰胺直接與BSA偶聯的方式合成抗原。由于Mel與BSA在堿性有機溶劑中反應時會導致BSA變性,因此選用較溫和的半抗原連接試劑盒,直接將Mel與BSA轉化連接得到BSA-Mel。

1.2.1.2 制備帶連接手臂的三聚氰胺抗原(BSA-ACS-Mel) 參考文獻[6]合成三聚氰胺與BSA之間帶有6個碳連接手臂的目標抗原,具體的合成路線如圖2所示。

連接轉化三聚氰胺半抗原(Mel-ACS):分別稱取CAAT 0.5g(3.4mmol)和ACS 0.5g(3.8mmol),溶于體積濃度為75%的乙醇溶液,加入縛酸劑,80℃回流滴加24h。用薄層層析法檢測反應進度,展開液組成及體積比例(乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸=8∶2∶1),紫外燈顯色檢測,半抗原及前體的最大紫外吸收波長為241nm。將反應產物放入旋轉蒸發器中蒸干,滴加質量濃度為10%的檸檬酸水溶液,調節酸堿度至pH2～3。過濾后,濾液減壓濃縮蒸干,即為目標產物(Mel-ACS)。為比較不同縛酸劑的作用效果,反應過程中分別等摩爾(即均以金屬陽離子四倍于ACS的量)加入NaOH 0.61g(15.2mmol)、KOH 0.85g(15.2mmol)、Na2CO30.81g(7.6mmol)、NaHCO31.29g(15.2mmol)和K2CO31.05g(7.6mmol)進行比較。

活化三聚氰胺半抗原:稱取Mel-ACS 20mg置于反應瓶中,依次加入N-羥基丁二酰亞胺(NHS)17mg(0.148mmol)和1mL二甲基甲酰胺(DMF),攪拌溶解,然后加入N,N′-二環己基碳二亞胺(DCC)31mg(0.15mmol),于4℃攪拌過夜,離心除去白色沉淀,得到上清液。

合成三聚氰胺偶聯抗原(BSA-ACS-Mel):在上清溶液中滴加溶有113mg BSA的PBS緩沖液(10mmol/L,pH7.4)8mL?；旌衔?℃攪拌過夜,最后用PBS透析,除去小分子雜質。

圖2 帶手臂三聚氰胺偶聯抗原(BSA-ACS-Mel)合成示意圖Fig.2 Synthesis route of melamine conjugate antigen(BSA-ACS-Mel)

由于三聚氰胺的分子結構高度對稱,三個氨基之間活性相同,反應活化過程難以控制,因此,選用結構與之接近但化學性質較活潑的氯代物CAAT作為反應起始物。通過CAAT活潑的氯與6個碳連接手臂ACS的氨基反應,連接形成Mel-ACS,然后活化ACS端的羧基端,在比較溫和的條件下將Mel-ACS與BSA連接。

1.2.2 三聚氰胺偶聯抗原的性質鑒定

1.2.2.1 三聚氰胺半抗原(Mel-ACS)的質譜表征 按1.2.1.2的方法,將所得純化目標物進行質譜表征,質譜儀的工作條件為:N2激光337nm,4次/秒脈沖,加速電壓20kV,真空度5×10-8mbar,真空管長度為1.5m,線性模式下操作,所得數據用Bruket XMASS軟件分析。

1.2.2.2 三聚氰胺半抗原的色譜測定 按1.2.1.2的方法,將所得的目標產物及反應前加入的CAAT、ACS進行色譜分析,二極管陣列檢測器波長215nm條件下HP1200高效液相色譜儀檢測。

1.2.2.3 CAAT轉化半抗原效率測定 將1.2.1.2合成三聚氰胺半抗原(Mel-ACS)中所得的白色固體稱重,熔點儀測熔點,并計算半抗原Mel-ACS的轉化效率。

Mel-ACS的轉化率(%)

1.2.2.4 三聚氰胺偶聯抗原反應原性鑒定 ELISA法鑒定三聚氰胺偶聯抗原:包被BSA-Mel、BSA-ACS-Mel及BSA,用最佳稀釋濃度的特異三聚氰胺單抗為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠多抗為二抗,四甲基聯苯胺(TMB)顯色。

Western blot鑒定三聚氰胺偶聯抗原:BSA-Mel、BSA-ACS-Mel及BSA進行電泳,特異三聚氰胺單抗作一抗,辣根過氧化物酶標記羊抗鼠多抗作二抗,二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.2.3 三聚氰胺偶聯抗原的免疫原性分析

1.2.3.1 三聚氰胺單克隆抗體的制備 用合成的三聚氰胺抗原分別免疫Balb/C小鼠,3次免疫后,取其脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合,用ELISA法篩選分泌抗體的陽性細胞,用有限稀釋法進行亞克隆,經過3次克隆后,建立穩定的雜交瘤細胞系,凍存。復蘇細胞,擴大培養,收集細胞培養上清[13]。

1.2.3.2 三聚氰胺單克隆抗體生物學特性鑒定 抗體類別鑒定:采用SBA ClonotypingTMSystem/HRP 抗體類型和亞類鑒定試劑盒,利用ELISA雙抗夾心法鑒定小鼠B淋巴細胞雜交瘤培養上清中單克隆抗體的類別。采用羊抗鼠抗體包被微孔板,與加入的培養上清中的小鼠抗體結合,再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗小鼠抗體分別反應,最后用TMB底物系統顯色并用稀硫酸終止,通過酶標儀檢測吸光度判斷被測單克隆抗體的類別。

1.2.3.3 單克隆抗體反應性鑒定 包被BSA-Mel及BSA-ACS-Mel抗原于聚苯乙烯酶標板,分別加入免疫制得的細胞培養上清孵育;以辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠多克隆抗體為二抗,TMB底物顯色;2M的硫酸水溶液終止,酶標儀A450nm檢測。

1.2.3.4 單克隆抗體的特異性鑒定 采用競爭ELISA法,選取反應性強的單克隆抗體,以間接ELISA測得A450nm在1.0左右的稀釋度作為工作濃度。將三聚氰胺標準品梯度稀釋,酶標板用4μg/mL的Mel-ACS-BSA包被,質量濃度為2%的PBS溶液封閉后,加入不同濃度的競爭三聚氰胺溶液50μL和稀釋為工作濃度的三聚氰胺單抗50μL,混勻后,37℃孵育1h。同時設空白對照,依據A450nm的變化判斷是否發生競爭反應。

2 結果與分析

2.1 合成三聚氰胺半抗原(Mel-ACS)的條件優化

在合成半抗原(Mel-ACS)的過程中,參考文獻[9],通過加入不同的縛酸劑NaOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3和K2CO3進行比較,結果只有K2CO3的催化效果最佳,轉化率達85.9%(見表1)。

在轉化連接帶手臂的半抗原時,對Mel與ACS的反應過程中加入等摩爾的縛酸劑,能吸收反應中產生的酸,避免影響反應或反應平衡。各組分經過熔點定性、色譜純度等分析比較,使用K2CO3的催化性能明顯好于NaOH、KOH、Na2CO3和NaHCO3,生成產物Mel-ACS的轉化連接效率高于其他縛酸劑的效率,達到了85.9%,為文獻[9]報導6.6%的十幾倍?？赡苁怯捎贙2CO3堿性相對較弱,在反應體系中向副產物提供未共用電子對的能力也較弱,反應的副產物少,CAAT轉化成Mel-ACS的反應效率較高。

2.2 三聚氰胺半抗原的鑒定

2.2.1 Mel-ACS高效液相色譜圖 對于轉化Mel-ACS前所用的原料CAAT(溶于DMF)、ACS(溶于水)以及轉化后的Mel-ACS(溶于水)在二極管陣列檢測器波長215nm條件下用HP1200高效液相色譜儀進行檢測,其色譜如圖3所示。

表1 不同縛酸劑對三聚氰胺半抗原合成的影響Table 1 Effect of different acid binding agents for the synthesis of melamine haptens

圖3 三聚氰胺半抗原色譜圖Fig.3 Chromatogram of melamine haptens注：A:CAAT;B:ACS;C:Mel-ACS純化前；D:Mel-ACS純化后。

由 CAAT、ACS及純化前的Mel-ACS色譜圖對比,可以看出純化前的Mel-ACS有別于CAAT(3.15min)和ACS,有新峰(4.28min)生成,對該峰進行純化得到純化后的Mel-ACS,見圖3D,產物進一步做質譜分析。

2.2.2 Mel-ACS質譜圖 對純化后的Mel-ACS的主峰進行質譜檢測分析,其結果如圖4所示。

圖4 三聚氰胺半抗原質譜圖Fig.4 Mass spectrometry of melamine haptens

半抗原Mel-ACS的分子式為C9H16N2O2,分子量為240.26,轉化產物Mel-ACS經質譜鑒定,質譜圖有一峰值240.26,說明連接轉化是成功的。

2.3 三聚氰胺抗原反應原性的鑒定

使用三聚氰胺特異性單抗、BSA單抗及作為對照的PBS分別與包被的BSA-ACS-Mel、Mel-BSA及BSA進行ELISA實驗,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠作為二抗反應,TMB顯色;結果只有BSA-ACS-Mel抗原與三聚氰胺特異性結合,如表2所示。

表2 三聚氰胺偶聯抗原反應性比較Table 2 Comparison of melamine conjugate antigens reactivity

注:“-”陰性;“+”陽性。

同時,對BSA-ACS-Mel、BSA -Mel、BSA進行電泳,特異性三聚氰胺單抗為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠多抗為二抗,DAB顯色,做Western blot,結果如圖5所示。

圖5 三聚氰胺偶聯抗原Western blot鑒定示意圖Fig.5 Identification of melamine conjugate antigen by Western blot注:Marker中70ku位置條帶為BSA,在2,3泳道相同位置均有顯色條帶,泳道4則無顯色。

在偶聯BSA后,由于抗原分子量太大,質譜、色譜等檢測方法已不適用,因此主要采用ELISA、Western blot等生物學方法測定。從Western blot電泳圖可以看出,泳道2和3特異的三聚氰胺抗體對兩種三聚氰胺偶聯抗原均有顯色,而與泳道4的BSA不反應,說明特異的三聚氰胺單抗可以識別偶聯抗原并與其反應顯色,證明三聚氰胺已偶聯到BSA上;泳道2反應明顯強于泳道3,表明帶手臂的偶聯抗原反應原性更強。而將兩種抗原均包被ELISA板,用特異三聚氰胺單抗做一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠多克隆抗體為二抗,TMB染色,結果只有帶連接手臂的偶聯抗原與特異三聚氰胺單抗結合顯色,無連接手臂的偶聯抗原不與特異三聚氰胺單抗結合顯色。進一步表明帶連接手臂的三聚氰胺偶聯抗原可能由于手臂的托舉提呈作用,Mel分子顯現出來,因此具有更好的反應原性。

2.4 三聚氰胺免疫原性的鑒定

使用兩種三聚氰胺偶聯抗原免疫小鼠,用各自的免疫抗原篩選,分別制備得到14株和34株單抗,經三聚氰胺阻斷鑒定,BSA-ACS-Mel抗原免疫所獲得的單克隆抗體中有6株具有較好的反應特異性,占總數的42.9%,免疫原性較強。而BSA-Mel抗原免疫所獲得的單克隆抗體則未能篩選出特異性的三聚氰胺單抗。以兩種不同抗原免疫得到的單克隆抗體亞類數量及其用三聚氰胺阻斷實驗的測定結果如表3所示:

表3 三聚氰胺偶聯抗原免疫原性對比Table 3 Comparison on immunity of melamine conjugates antigens

經過動物體內免疫,帶連接手臂的抗原得到了14株單抗,其中6株三聚氰胺單抗具有特異性,而無連接手臂的抗原得到34株單抗,但經阻斷實驗證明均不具有特異性。說明無連接手臂的偶聯抗原免疫原性弱,很難獲得針對三聚氰胺的特異性單抗。而帶連接手臂的三聚氰胺抗原,由于手臂有利于減少抗原抗體識別時的空間位阻作用,能將三聚氰胺分子提呈到整個抗原分子的表面,因而具有較好的免疫原性,更適合做為免疫原。

3 結論

通過改進抗原制備方法得到帶手臂的三聚氰胺抗原,免疫動物后獲得特異性單克隆抗體,經ELISA、Western blot等方法進行免疫原性分析,證明該方法具有轉化效率高(轉化率85.9%),偶聯抗原的反應原性及免疫原性(特異性單抗獲得率42.9%)均較好等優點,可以用于三聚氰胺的快速免疫檢測等方面,并對其它小分子抗原的合成和鑒定提供參考。

[1]Neerman MF,Chen HT,Parrish AR,et al. Reduction of drug toxicity using dendrimers based on melamine[J]. Mol Pharm,2004,1(5):390-393.

[2]馮楠,路勇,吳穎,等. 超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)測定多種食品中三聚氰胺的殘留量[J]. 中國衛生檢驗雜志,2009,19(2):248-250.

[3]GC-MS Screen for the presence of melamine and cyanuric acid[S]. FDA-ORA Forensic chemistry center SOP T015.

[4]Updated FCC developmental melamine quantitation(HPLC-V)[S]. FDA-ORA Forensic chemistry center SOP T015.

[5]沈昊宇,趙永綱,王樂屏,等. 三聚氰胺及其相關物質的性質、危害與檢測技術[J]. 化學通報,2009(4):341-349.

[6]孔君,劉箐,韓躍武,等. 單克隆抗體制備技術的最新進展及應用前景[J]. 免疫學雜志,2011,27(2):170-173.

[7]夏駿,賴衛華,涂繼平,等. 三聚氰胺膠體金免疫層析方法的建立[J]. 食品科學,2013,34(20):139-143.

[8]饒欽雄,童敬,王金芳,等. 飼料和食品中三聚氰胺的毒性及殘留檢測方法的研究進展[J]. 飼料工業,2009,30(11):34-36.

[9]Lei HT,Shen YD,Song LJ,et al. Hapten synthesis and antibody production for the development of a melamine immunoassay[J]. Analytica Chimica Acta,2010,665:84-90.

[10]宋建武,晁志,董為人. 石杉堿甲人工抗原的合成、鑒定及免疫原性分析[J]. 第三軍醫大學學報,2009,31(21):2128-2130.

[11]陳繼明,龔曉明,陸承平. T細胞表位研究進展[J]. 中華微生物學與免疫學雜志,1998,18(1):78-82.

[12]沈關心,周汝麟. 現代免疫學實驗技術[M]. 武漢:湖北科學技術出版社,1998:7-8.

[13]任立松,王穎,黨榮理,等. 蘇丹紅單克隆抗體的制備與鑒定[J]. 中國衛生檢驗雜志,2008,18(2):201-203.

Preparation and immunogenicity analysis of melamine conjugate antigen

ZHAO Peng-hua1,ZHANG Hai-xiang1,+,LI Tao2,WANG Xin1,SONG Wei3,LIU Hai-jing2,XIE Yi1,HUO Xue-ping1,ZHAO Xiang-rong1,LIANG Dao-yan1,LI Yuan1,*,HU Jun1,*

(1.Center Laboratory,Shaanxi Provincial People’s Hospital,Xi’an 710068,China;2.Shaanxi Institute for Food and Drug Control,Xi’an 710065,China;3.Xi’an Huaaolikang Biology Engineer Co.,Ltd.,Xi’an 710061,China)

The starting material 2- chloro-4,6- diamine-1,3,5- triazine(CAAT)reacted with 6- aminocaproic acid(ACS)to create a hapten Mel-ACS,then this hapten was conjugated with bovine serum albumin(BSA)to form BSA-ACS-Mel,which was supposed to have a connection arm and would be used as an antigen for the preparation of monoclonal antibody(mAb). Antigenic characteristics analysis by HPLC,Western blot and ELISA proved that the yield of hapten Mel-ACS reached 85.9% and specific monoclonal antibodies against Mel reached 42.9%. The antigen BSA-ACS-Mel had good immunogenicity and can be applied to detect melamine molecule specifically. This method played a guiding role in the synthesis of other small molecule antigens.

melamine;antigen;monoclonal antibody;immunogenicity

2014-09-04 +并列第一作者。

趙彭花(1984- )，女，碩士，助理研究員，研究方向:生物化學合成及應用。 張海祥(1975-)，男，碩士，高級工程師，研究方向:生物技術。

*通訊作者:李元(1960-)，男，博士，教授,研究方向:微生物學。 胡軍(1962-)，男，博士，研究員, 研究方向:免疫學。

陜西省食品藥品快速檢測公共服務平臺建設項目(2014FWPT-01)；陜西省科學技術研究發展計劃項目(2014K12-05)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)13-0329-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.060