猴頭菇多糖對小鼠抗疲勞作用研究

楊 雪,張海悅,張 鑫,李 震

(長春工業大學化學與生命科學學院,吉林長春 130012)

猴頭菇多糖對小鼠抗疲勞作用研究

楊 雪,張海悅*,張 鑫,李 震

(長春工業大學化學與生命科學學院,吉林長春 130012)

研究猴頭菇多糖的抗疲勞作用及單糖組成。分別以猴頭菇粗多糖(Crude polysaccharide fromHericiumerinaceus,HEPC)、中性多糖(Neutral polysaccharide fromHericiumerinaceus,HEPN)、酸性多糖(Acidic polysaccharide fromHericiumerinaceus,HEPA)和蒸餾水灌胃小鼠,連續灌胃15d后進行負重游泳實驗,考察其對力竭游泳時間及血乳酸(Blood lactic acid,BLA)、血清尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、肝糖原(Hepatic glycogen,HG)含量的影響。結果顯示猴頭菇多糖,特別是酸性多糖能顯著延長小鼠負重游泳時間,提高小鼠體內肝糖原的儲備量,降低小鼠血乳酸和血清尿素氮含量。該結果表明猴頭菇多糖對小鼠具有抗疲勞作用,且猴頭菇酸性多糖的作用最強。將猴頭菇多糖水解和PMP衍生化后,用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)分析其單糖組成,顯示猴頭菇多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸組成的雜多糖。

猴頭菇多糖,抗疲勞,單糖組成

猴頭菇是一種藥食同源的真菌,常見于亞洲東亞地區,史載于《農政全書》。東北猴頭菇已經有2000多年的歷史,在中國長白山上資源極為豐富。由于其優越的自然生長條件,在營養價值方面也優于其他的猴頭菇。猴頭菇多糖可抗潰瘍[1],抗腫瘤[2],可明顯改善環磷酰胺引起免疫抑制小鼠的非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫功能的低下狀況[3],提高機體耐缺氧能力[4],但對其抗疲勞活性鮮有報道。僅魏躍臣等對猴頭菇的抗疲勞進行研究,結果表明復方猴頭菇飲料具有明顯的抗疲勞作用[5]。疲勞是指在特定水平上機體生理過程不能維持預定的運動強度,或不能持續其功能致使身體和精神狀態下降,從而導致工作能力和工作效率的衰退[6]。忙碌的生活,讓“過勞模”們無法從壓力中完全逃開,因此,如何緩解疲勞和抵抗疲勞成為目前運動醫學和保健醫學研究的一個熱點問題。本文研究了猴頭菇多糖對小鼠抗疲勞作用的影響,并分析了其單糖組成,為猴頭菇多糖抗疲勞活性研究及其相關保健食品應用開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇 購買于吉林省長白山二道白河,由東北師范大學生物系鑒定;18～22g清潔級(CL)昆明種雄性小白鼠 購買于吉林大學動物實驗中心。

血乳酸(BLA)試劑盒、血尿素氮(BUN)試劑盒、肝糖原(HG)試劑盒 南京建成生物工程研究所;DEAE - 纖維素 上海恒信化學試劑有限公司;間羥基聯苯 東京化成工業株式會社;甘露糖、鼠李糖葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖標準品 上海時代生物科技有限公司;其它試劑 均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DGSY-Ⅲ電熱恒溫水浴鍋 北京市意成科技開發公司;TGL-16A 高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;Sigma3K-15 高速冷凍離心機 博勵行實驗儀器有限公司;FD-1A-50 冷凍干燥機 北京博醫康技術公司;離子交換柱(8.0×20) 上海滬西分析儀器廠;HL-2橫流泵 上海滬西分析儀器廠;BS-100A自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠;752型紫外可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司;HY-4調速多用振蕩器 金壇市榮華儀器制造有限公司;LC-10AT/Series III 高效液相色譜儀 日本島津蘇州公司/美國科學系統公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 猴頭菇粗多糖、中性多糖和酸性多糖的制備 將猴頭菇子實體分離出來切塊兒,烘干至恒重粉碎過篩。稱取猴頭菇子實體粉末,加20倍蒸餾水,80℃下,浸提過濾3次,每次4h,合并三次濾液,減壓濃縮至1/2,Sevag法除蛋白5次,離心去除游離蛋白產生的凝膠狀沉淀,上清液減壓濃縮,揮發除去有機溶劑,即得濃縮液,加入4倍體積的95%乙醇,抽濾,收集沉淀,待復溶于蒸餾水后,冷凍干燥,即得猴頭菇粗多糖[7]。

稱取猴頭菇粗多糖,溶解于蒸餾水中(磁力攪拌器攪拌過夜,使之充分溶解),用蒸餾水、0.5mol/L NaCl經DEAE-纖維素柱(8.0×20)洗脫,流速12.5mL/min,每管收集50mL洗脫液,用苯酚硫酸法和間羥基聯苯法檢測洗脫液,根據洗脫峰收集制備液,濃縮制備液,透析去除NaCl,冷凍干燥即得猴頭菇中性多糖和酸性多糖[8]。

1.3.2 小鼠負重游泳實驗條件及環境 將18～22g清潔級(CL)雄性昆明種小鼠40只,隨機的分成四組,每組10只。在負重游泳實驗前一周對動物進行檢疫,檢疫期間,小鼠在室溫20～23℃下自由攝食和取水,自然采光,并保持通風換氣。根據《家常養生祛病食療寶典》中猴頭菇推薦成人每日適宜攝入量為30g,根據本實驗猴頭菇粗多糖、酸性多糖、中性多糖得率分別為3%、0.66%、1.7%,即成人每日適宜攝入量分別為900、510、198mg,我國成人總平均體重60kg,則成人推薦劑量分別為15mg/(kg·d)、8.5mg/(kg·d)、3.3mg/(kg·d)體重,根據《保健食品功能評價》實驗組小鼠按相當于人體推薦劑量的30倍進行灌胃,即以100mg/(kg·d)體重灌胃,對照組以蒸餾水灌胃,灌胃體積為0.4mL/20g體重,連續灌胃15d,第15d灌胃受試物30min后,給予小鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮在有機玻璃水槽(長:50cm,寬:50cm,深:40cm,水溫26℃±1.0℃中進行負重游泳實驗,注意每只小鼠,使其四肢不停運動,用秒表記錄小鼠入水至頭部全部入水持續8s不能浮出水面為止的時間[9]。

1.3.3 生化指標的測定 將游泳力竭的小鼠從水槽中撈出,即刻于眼眶采血,靜止3h后4000r/min離心10min取上清液,分別用血乳酸(BLA)試劑盒、血尿素氮(BUN)試劑盒,結合752型紫外可見光分光光度計(比色法)檢測血乳酸(BLA)和血清尿素氮(BUN)的含量。

將采血后的實驗小鼠脫臼處死立即取出肝臟用生理鹽水漂洗,再用濾紙吸干,精確稱取處理后的肝臟100mg,加入5%三氯醋酸(TCA)8mL,勻漿處理,然后將勻漿液倒入離心管中,在4000r/min下離心10min,之后每管加入4mL 95%的乙醇,充分混勻。于室溫下豎立放置過夜。沉淀完全后,4000r/min離心10min。在將試管倒立放置10min,之后用2mL蒸餾水溶解糖原,肝糖原(HG)試劑盒結合752型紫外可見光分光光度計(比色法)測定肝糖原(HG)含量[10]。

1.3.4 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化 PMP是還原糖衍生化的最有效試劑之一,其優點是產物不易裂解,不產生異構峰,且在245nm處有強烈的紫外吸收,可應用高效液相、毛細管電泳的技術加以分析。此方法操作簡單,靈敏度高,可用于大批量樣品的分析。向完全酸水解后獲得的干燥樣品中加入PMP試劑0.5mL和0.3mol/L的NaOH溶液0.5mL,待樣品充分溶解后取其中的0.1mL于小離心管中,70℃水浴30min。10000r/min離心5min后,加入0.3mol/L鹽酸溶液0.05mL和蒸餾水0.05mL,充分混勻。加入1mL三氯甲烷,混勻后抽提剩余的PMP試劑,吸去三氯甲烷層,保留水層。用0.22μm濾膜過濾后,加入適量蒸餾水稀釋后,待HPLC檢測[11]。

1.3.5 HPLC分析 采用Shimadzu HPLC系統(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外光檢測器),DIKMAInertsil ODS-3色譜柱(4.6×150mm),流動相為PBS(0.1M,pH7.0)-乙腈82∶18(v/v),流速為1.0mL/min,進樣量為20μL,檢測波長為245nm[12],樣品與9種混合標準品,進行出峰時間與出峰面積的對照。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 猴頭菇多糖離子交換柱層析制備

猴頭菇粗多糖經DEAE-纖維素柱分級,用蒸餾水和0.5mol/L NaCl溶液洗脫后于每個梯度各得一個級分,由苯酚硫酸法和間羥基聯苯法分別檢測洗脫液的總糖和糖醛酸分布情況,如圖1所示,水洗脫級分命名為HEPN,多糖得率為1.7%;0.5mol/L NaCl溶液洗脫級分,命名為HEPA,多糖得率為0.66%。由蒸餾水洗脫出來的洗脫液中未檢測出糖醛酸,洗脫峰單一,說明該柱效較好,可很好地吸附酸性糖,將中性糖單一洗出。由0.5mol/L NaCl溶液洗脫出來的洗脫液,總糖與糖醛酸洗脫峰基本重合,且洗脫峰單一,說明吸附在DEAE-纖維素柱上的酸性糖被充分洗脫下來,此步完成了對猴頭菇中性糖和酸性糖的制備。制得的猴頭菇粗多糖為棕黃色粉末,中性多糖和酸性多糖為淡黃色粉末,無異味,多糖含量≥90%,溶解度≥99%,水分≤6%,灰分≤4%。

圖1 猴頭菇多糖的洗脫曲線Fig.1 The elution curves of HEP

2.2 猴頭菇多糖對小鼠力竭游泳時間的影響

由表1可知,與灌胃蒸餾水的對照組相比,灌胃多糖的實驗組小鼠游泳時間較長。其中,HEPA組小鼠游泳時間最長,與對照組相比,差異極顯著(p<0.01),力竭游泳時間增加了146.7%;HEPC組和HEPN組與對照組相比,差異顯著(p<0.05),力竭游泳時間分別增加了53.9%和51.2%。這說明猴頭菇多糖能夠提高小鼠運動耐力[12],延長了小鼠運動時間,具有緩解疲勞的作用,以猴頭菇酸性多糖作用尤為突出。小鼠負重游泳時間的長短可以較好地反映動物運動耐力,小鼠負重游泳實驗時,肌肉不僅消耗糖原,還大量攝取血糖。當攝取速度大于肝糖原的分解速度時,血糖水平降低。由于中樞神經系統主要靠血糖供能,血糖降低引起中樞神經系統供能不足,從而導致全身性疲勞的發生。本實驗中灌胃猴頭菇多糖的小鼠血清尿素氮含量(HEPC組<0.05;HEPN組<0.05;HEPA組<0.01)也低于對照組,說明猴頭菇多糖可延緩蛋白質與氨基酸的分解,機體仍能夠承受負荷,延長小鼠負重游泳時間(HEPC組<0.05;HEPN組<0.05;HEPA組<0.01)。

表1 猴頭菇多糖對小鼠力竭游泳時間的影響Table 1 Effect of HEP on the exhaustive swimming time of mice(x±s,n=10)

注:*.與對照組相比,差異顯著(p<0.05);**.與對照組相比,差異極顯著(p<0.01)。

2.3 猴頭菇多糖對小鼠相關生化指標的影響

由表2可知,與灌胃蒸餾水的對照組相比,灌胃多糖的實驗組小鼠BLA、BUN含量降低,HG含量增加。說明猴頭菇多糖具有控制小鼠運動代謝情況,能量物質儲存及動員情況的作用[14]。其中,HEPC組、HEPN組和HEPA組小鼠BLA含量,與對照組相比,差異顯著(p<0.05)。說明猴頭菇多糖能加快乳酸的清除代謝速度,有氧代謝能力提高,有利于疲勞的迅速消除[15]。HEPA組小鼠BUN,HG含量,與對照組相比,差異極顯著(p<0.01);HEPC組和HEPN組小鼠BUN,HG含量,與對照組相比,差異顯著(p<0.05)。說明猴頭菇酸性多糖對小鼠耐力增加,提高小鼠負荷適應能力作用尤為顯著。運動耐力的提高是抗疲勞能力加強的宏觀表現。同時,與疲勞產生機制有關的生物化學指標可以評價某一保健食品或藥物是否有抗疲勞的作用及其效果如何。其中,血乳酸、血清尿素氮和肝糖原含量等生化指標最具有代表性,反映了運動時物質代謝情況和能量物質儲存、動員情況。本實驗中猴頭菇多糖可提高小鼠體內肝糖原的儲備量(HEPC組<0.05;HEPN組<0.05;HEPA組<0.01),維持小鼠運動時的血糖水平,延緩疲勞感的產生。本實驗中灌胃猴頭菇多糖的小鼠血乳酸含量(HEPC組<0.05;HEPN組<0.05;HEPA組<0.05)明顯低于對照組,說明猴頭菇多糖能夠提供能源物質,減少乳酸堆積,減緩疲勞程度。

表2 猴頭菇多糖對小鼠相關生化指標的影響Table 2 Effect of HEP on the related biochemical indexes of mice(x±s,n=10)

注:*.與對照組相比,差異顯著(p<0.05);**.與對照組相比,差異極顯著(p<0.01)。

2.4 猴頭菇多糖的單糖組成

由表3可知,猴頭菇粗多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸組成的雜多糖。酸性糖部分由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸組成。中性糖主要組分有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖。

表3 猴頭菇多糖的單糖組成Table 3 The monosaccharide composition of HEP

3 結論

猴頭菇多糖可以延長小鼠負重游泳時間,能提供能源物質,減少乳酸堆積,減緩疲勞程度,對小鼠具有抗疲勞作用,以猴頭菇酸性多糖作用尤為突出,其抗疲勞作用的具體機制有待進一步研究。單糖組成結果顯示,猴頭菇多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸組成的雜多糖。

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Anti-fatigue effects of polysaccharides fromHericiumerinaceusin mice

YANG Xue,ZHANG Hai-yue*,ZHANG Xin,LI Zhen

(College of Chemical and Life Science,Changchun University of Technology,Changchun 130012,China)

To investigate the anti-fatigue effects of polysaccharides fromHericiumerinaceus(HEP)and monosaccharide composition. Mice were orally administrated with Crude polysaccharide fromHericiumerinaceus(HEPC),Neutral polysaccharide fromHericiumerinaceus(HEPN),Acidic polysaccharide fromHericiumerinaceus(HEPA)and distilled water. After 15 days,all mice were subjected to weight-loaded swim test. The exhaustive swimming time,blood lactic acid,blood urea nitrogen and hepatic glycogen were measured. The results showed that HEP especially HEPA could significantly lengthen the swimming time of mice,improve the mice hepatic glycogen reserves,reduce blood lactic acid and blood urea nitrogen content. The HEP has anti-fatigue function and the strongest was HEPA. After PMP derivatization,High performance liquid chromatography(HPLC)was used for analyzing monosaccharide composition of polysaccharides. The result indicated that HEP was heteropolysaccharide and consisted of mannose,rhamnose,glucose,galactose,fucose and glucuronic acid.

polysaccharides fromHericiumerinaceus(HEP);anti-fatigue;monosaccharide composition

2014-08-22

楊雪(1989-),女,碩士,研究方向:天然產物開發。

*通訊作者:張海悅(1967-),女,博士,教授,研究方向:天然產物開發。

TS201.4

A

1002-0306(2015)13-0368-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.069