響應面法優化蘋果渣生產細菌纖維素培養基及產物性能研究

張 雯,李宏杰,劉 蘭,齊香君

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021；2.華東醫藥集團,浙江杭州 311000)

響應面法優化蘋果渣生產細菌纖維素培養基及產物性能研究

張 雯1,李宏杰2,劉 蘭1,齊香君1

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院,陜西西安 710021；2.華東醫藥集團,浙江杭州 311000)

為提高木醋桿菌(Acetobacterxylinum)發酵蘋果渣水解液生產細菌纖維素(Bacterial cellulose,BC)的產量,采用響應面法對發酵培養基進行優化,同時利用傅里葉紅外光譜(FT-IR)和X-射線衍射(XRD)對發酵產物BC的性能和結構進行比較。單因素及響應面實驗結果確定木醋桿菌(Acetobacterxylinum)發酵蘋果渣水解液生產BC的最佳培養基配方為:蔗糖38.44 g、蛋白胨10.91 g、硫酸鎂0.85 g、黃嘌呤0.87 g、乙醇10 mL、蘋果渣水解液1000 mL、pH6.0,在此條件下BC的產量為7.19 g/L,較優化前(5.65 g/L)提高了27.3%。蘋果渣水解液發酵產物BC結構性能與基本培養基發酵產物BC基本一致。說明蘋果渣能夠替代部分發酵原料發酵生產BC,且不影響BC性能。

蘋果渣,細菌纖維素,培養基優化,響應面法

細菌纖維素(Bacterial cellulose,簡稱 BC)是由生長在液態含糖基質中的革蘭氏陰性菌產生的纖維素成分。與植物纖維素相比,BC不含半纖維素和木質素,具有高持水率(大于90%)、高分子量以及較高的結晶度。目前,BC作為一種新型功能材料受到了科學界的廣泛關注,已成功地應用于食品、生物醫學、膜濾器等多個領域[1-2]。目前BC的生產原料大多為椰汁或復合培養基,主要集中在東南亞等國家。單一的生產原料及地域限制使BC存在生產及運輸成本過高等問題,只能應用于高附加值產品的開發。降低生產成本、擺脫原料地域限制是我國BC產業面臨的一個重大挑戰[3]。

蘋果渣是蘋果汁加工業的副產物,富含碳水化合物、礦物質等多種營養成分[4-6]。果汁加工業所產生的大量蘋果渣用作肥料、燃料的占15%～20%,用作飼料的約為10%,其余絕大部分直接廢棄,造成了嚴重的資源浪費和環境污染。蘋果渣中含有的纖維素,經過適當處理后,可以轉化為小分子糖,另外,它含有的微量礦物質也是微生物生長繁殖的理想原料。Joshi V.K.等[7-8]將蘋果渣分別接入啤酒酵母、產骯假絲酵母、產蛋白酵母等進行固態發酵,Sandhu等人[9]利用酵母發酵蘋果渣產生乙醇、粗蛋白和可溶蛋白。本研究擬利用蘋果渣水解液作為原料生產BC,采用響應面法對BC發酵培養基進行優化。同時研究發酵產物BC性能,探索蘋果渣作為發酵原料對BC的影響。本研究可為BC發酵提供一種廉價原料,為蘋果渣的綜合利用、附加值的提升和果汁的清潔化生產提供一條新的途徑,具有良好的社會效益及經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 木醋桿菌(Acetobacterxylinum);蘋果渣 陜西海升果業發展股份有限公司;纖維素酶 700 EGU/g，諾維信中國生物技術有限公司;其余試劑均采用國產分析純或生化試劑。

固體培養基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氫二鈉4.40 g、檸檬酸0.80 g、瓊脂18.00 g、乙醇10 mL、自來水1000 mL、pH6.0;種子培養基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氫二鈉4.40 g、檸檬酸0.80 g、乙醇10 mL、自來水1000 mL、pH6.0;基本發酵培養基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、蘋果渣水解液1000 mL、pH6.0。

D/max2200PC全自動X-射線衍射儀 日本Rigalcu;VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜儀 德國Brucher公司;MG250B恒溫培養箱、HYG-1A恒溫振蕩器 上海新瑞儀器有限公司;XPS-8CA光學顯微鏡 上海光學儀器有限公司;752型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定分析方法

1.2.1.1 還原糖的測定 采用DNS法[10];

1.2.1.2 BC膜處理 將發酵所得BC膜浸泡于0.10 mol/L NaOH溶液中,80 ℃浸泡30 min,繼續加熱煮沸2 h,再用蒸餾水反復沖洗,直到pH為7.0,冷凍干燥[11-12];

1.2.1.3 BC膜產量測定 采用稱重法[13];

1.2.1.4 BC鑒定及基團分析 采用傅里葉紅外光譜掃描法[12](樣品處理:取適量BC干膜放入紅外光譜儀中進行測定,450 mW,掃描范圍4500～400 cm-1,設定分辨率4 cm-1,掃描速度為0.2 cm/s,室溫下操作)。

1.2.1.5 BC膜結晶度 采用X-射線衍射光譜掃描法[12](樣品處理:BC干膜平整固定在樣品架上,銅靶,測試電壓40 kV,測試電流100 mA,速率5 °/min,步寬0.02 °,2θ為0～80 °范圍掃描。根據X衍射參數,由下面兩個計算公式分別計算細菌纖維素的結晶度(Xc)和晶體的粒徑L;

式中:I為衍射峰的衍射強度;Iam為無定形區衍射強度;β為半峰寬(rad);k為常數,通常取0.89;λ為X射線波長(0.15406 nm);θ為布拉格衍射角。

1.2.2 蘋果渣水解液的制備 取經粉碎干燥的蘋果渣,加自來水至液固比為8∶1,加纖維素酶至終濃度為40.00 EGU/g,pH5.2～5.5、55 ℃水解14 h,反應結束后升溫至100 ℃,維持10 min滅酶,得蘋果渣水解液。

1.2.3 BC的發酵 斜面培養:挑取木醋桿菌保藏菌種劃斜面,30 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d;種子液制備:挑取木醋桿菌活化菌種接種子培養基,30 ℃恒溫培養箱中培養1 d,培養液置于30 ℃,160 r/min搖床震蕩30 min,得種子液;發酵培養:移取木醋桿菌種子液接入發酵培養基,裝液量30 mL/250 mL三角瓶,接種量20%,30 ℃恒溫培養箱中靜置培養10 d。

1.2.4 單因素實驗 以發酵液中BC產量為指標,考察碳源種類及含量(葡糖糖、蔗糖、乳糖,設計質量濃度0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 g/L)、氮源種類及含量(牛肉膏、蛋白胨、麩皮,設計質量濃度0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 g/L)、無機鹽種類及含量(硫酸鎂、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉,設計質量濃度0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 g/L)、磷酸二酯酶抑制劑種類及含量(黃嘌呤、咖啡因,設計質量濃度0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10、1.50、2.00 g/L)等因素對BC產量的影響。初始培養基配方為:蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、蘋果渣水解液1000 mL、pH6.0,后續因素的實驗將前一個因素的較佳條件帶入以置換初始條件。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗結果基礎上,采用Design Expert7.0軟件,根據Box-Benhnken實驗設計原理,選取影響較大的因素,以發酵液中BC產量為響應值設計實驗,響應面因素水平設計見表1。

表1 響應面因素水平表

1.2.6 發酵產物性能研究 以木醋桿菌(Acetobacterxylinum)為菌種,按照優化培養基配方制備蘋果渣水解液發酵培養基發酵生產BC,記為BC-YP,利用基本培養基發酵生產BC記為BC-DZ。利用傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)及X-射線衍射儀(XRD)對BC-YP及BC-DZ進行檢測,研究蘋果渣水解液作為發酵培養基原料對BC性能的影響。

1.3 數據處理方法

所有數據均用三次平行實驗的平均值表示,用SPSS(PASW Statistics18)軟件對數據進行處理。方差分析及多重比較中p<0.05為顯著差異,記為*。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 碳源對BC產量的影響 由圖1可知,隨著發酵培養基中所加入碳源質量濃度升高,BC產量呈先上升再下降的變化趨勢。葡萄糖質量濃度低于30.00 g/L,蔗糖和乳糖質量濃度低于40.00 g/L時,BC產量隨著糖濃度的增大呈上升趨勢。之后BC產量反而降低。相同質量濃度水平下,蔗糖作為碳源時BC產量最大,其次分別是乳糖、葡萄糖。分析原因,主要有以下幾個方面:蘋果渣水解液中糖含量較低,所提供碳源不能滿足產物的持續合成,因此隨著外源碳源的加入量增大,BC產量隨之提高;添加碳源量過高時,易引起培養基滲透壓過高,反而抑制菌體細胞的生長及產物的合成,使BC產量降低;相較于蔗糖和乳糖,葡萄糖為微生物的快速利用碳源。高質量濃度葡萄糖的快速利用,容易引起糖代謝途徑中丙酮酸的積累及無氧酵解產物乳酸、醋酸等的產生,使發酵液pH降低,不利于細胞的生長及產物的合成[11]。同時快速利用基質的利用易產生對產物合成相關酶的阻遏作用,不利于發酵過程由細胞生長期轉為產物生產期,從而降低產物產量;蔗糖和乳糖作為碳源時,微生物對其水解速率不同,其利用速率也不相同。培養基中添加40.00 g/L的蔗糖比相同質量濃度的乳糖發酵產BC產量高,可能是因為木醋桿菌Acetobacterxylinum在代謝過程中將蔗糖水解為葡萄糖及果糖,其代謝及利用速率更適宜于產物BC的合成,因而可促進BC的合成。因此選擇蔗糖質量濃度40.00 g/L為較佳參數。

圖1 碳源種類及質量濃度對BC產量的影響Fig.1 Effect of carbon source’s types and mass concentration on BC productivity

2.1.2 氮源對BC產量的影響 由圖2可知,發酵培養中分別加入牛肉膏、麩皮、蛋白胨作為氮源時,隨著氮源質量濃度的升高,BC產量呈先上升再下降的趨勢,其最大產量對應氮源質量濃度均為10.00 g/L。表明蘋果渣水解液中缺乏微生物合成BC所需蛋白質,需要外源添加氮源,最適添加量10.00 g/L。氮源添加量繼續增加時,發酵培養基中氮源的質量濃度過高,易引起菌體細胞生長速率過快,不利于發酵過程由細胞生長期轉為產物生產期,從而降低BC產量。所添加三種氮源中,蛋白胨作為氮源時,BC產量最高,可達6.51 g/L,表明蛋白胨為木醋桿菌發酵生產BC最佳氮源。因此選擇蛋白胨質量濃度10.00 g/L為較佳參數。

圖2 氮源種類及質量濃度對BC產量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source’s types and mass concentration on BC productivity

2.1.3 無機鹽對BC產量的影響 由圖3可知,培養基中MgSO4質量濃度為1.00 g/L時,BC產量最高達6.86 g/L。Mg2+是微生物代謝過程中多種酶的輔基,如大部分核酸復制轉錄相關酶均需Mg2+保證其催化活性,因此,發酵培養基中添加合適濃度的Mg2+,對BC的合成具有促進作用。這與Son等人的研究結果一致[14]。同時,發酵培養基中K2HPO4的加入并沒有對BC的合成表現出促進作用,BC產量反而有所降低,分析原因,可能是培養基中過量的磷酸鹽對糖代謝過程中戊糖磷酸途徑產生了抑制作用,從而抑制BC的合成。培養基中檸檬酸鈉的加入對BC產量影響不大。因此培養基中無機鹽選擇硫酸鎂進行進一步研究。

圖3 無機鹽種類及質量濃度對BC產量的影響Fig.3 Effect of inorganic salt's types and mass concentration on BC productivity

2.1.4 PDE抑制劑對BC產量的影響 由圖4可知,發酵培養基中黃嘌呤和咖啡因的加入對BC的合成具有明顯的促進作用,添加黃嘌呤質量濃度為0.90 g/L,咖啡因質量濃度為0.70 g/L時,BC產量可分別提高14.2%,5.7%。BC生物合成過程中,纖維素合成酶在環鳥苷酸(C-di-GMP)的激活下能夠保持較高活性,C-di-GMP又能被磷酸二酯酶(PDE)水解為無活性的線狀鳥苷酸,因此理論上PDE抑制劑能夠促進BC的合成。咖啡因、黃嘌呤和茶堿等可抑制PDE的活性[15],使C-di-GMP在細胞內保持較高水平,提高纖維素合成酶活性,從而提高BC的合成速度。實驗結果與理論分析一致。培養基中PDE抑制劑選擇黃嘌呤進行進一步研究。

圖4 PDE酶抑制劑對BC產量的影響Fig.4 Effect of PDE inhibitor on BC productivity

2.2 響應面優化發酵培養基配方

2.2.1 響應面實驗設計及結果 綜合單因素實驗結果,進一步對蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂及黃嘌呤質量濃度4個因素進行優化。以這4個因素為自變量,以BC產量為響應值,根據Box-Behnken實驗設計原理,設計中心組合實驗,實驗結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果

2.2.2 響應面分析 利用Design Expert 7.0 軟件對二次回歸模型進行規范分析,蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂及黃嘌呤質量濃度之間交互作用對BC產量的影響見圖5。

結合表3所示方差分析結果,由圖5所示響應面曲線3D圖及等高線圖分析可知[16]:硫酸鎂與蔗糖、硫酸鎂與蛋白胨、黃嘌呤與硫酸鎂對BC產量影響的交互作用較強。同時由圖可知,蔗糖、硫酸鎂、黃嘌呤對BC產量的影響比較顯著,曲線較陡;而蛋白胨對BC產量的影響相對較小,曲線較平緩,其數值的增加減少,對響應值的變化影響較小。

2.2.3 最佳發酵培養基 由Design 軟件求出回歸模型極值點,對應的最佳發酵培養基組分為:蔗糖質量濃度38.44 g/L、蛋白胨質量濃度10.91 g/L、硫酸鎂質量濃度0.85 g/L、黃嘌呤質量濃度0.87 g/L,此條件下,BC的理論產量為7.31 g/L。為檢驗響應面法的可靠性,在最佳培養基條件下進行驗證實驗。此條件下進行3次平行實驗,BC平均產量為(7.19±0.15)g/L,與理論值的相對誤差為1.6%。說明回歸方程能比較真實地模擬各因素對BC產量的影響,因此,使用該回歸模型優化利用酒糟水解液發酵生產BC的培養基是可行的。

2.3 發酵產物的結構與性能

表3 回歸方程方差分析結果

圖5 交互因素對BC產量的影響響應面曲線圖Fig.5 Response surface plots showing the effects of interactions of factors on the yield of BC

注:** 差異極顯著,p<0.01;* 差異顯著,p<0.05。

酒糟水解液發酵BC(BC-YP)與基本培養基發酵BC(BC-DZ)紅外圖譜如圖6所示。吸收峰3285、1154、1077、1040 cm-1證實了樣品中大量-OH的存在;吸收峰2925、1383、645 cm-1證實了-CH2-、-CH-和C-H的存在;吸收峰1241 cm-1證實了環C-O-C的存在;吸收峰1241、1033 cm-1證實了直鏈C-O-C的存在[17-18]。以上結果顯示為細菌纖維素葡聚糖的特征吸收,可以推斷出兩種樣品的主要成分均為細菌纖維素。由圖6可知,BC-YP和BC-DZ紅外圖譜基本一致,說明兩種樣品的化學組成非常相似,蘋果渣水解液作為發酵原料不影響BC的化學結構。

圖6 基本培養基發酵BC(BC-DZ)與蘋果渣水解液發酵BC(BC-YP)紅外圖譜Fig.6 FT-IR of BC produced from basic medium(BC-DZ) and BC from pomace hydrolysate (BC-YP)

蘋果渣水解液發酵BC(BC-YP)與基本培養基發酵BC(BC-DZ)XRD圖譜如圖7所示。由圖可知,BC-YP 和BC-DZ的X-射線圖譜大致相同,且在相同位置處均含有主要衍射峰,分別在14.8°、16.8°和21.7°附近存在三個衍射峰,此三個峰分別對應纖維素晶體的<101>、<101>和<002>晶面[19],據此可知BC-YP 和BC-DZ為Ⅰ型纖維素。

圖7 基本培養基發酵BC(BC-DZ)與蘋果渣水解液發酵BC(BC-YP)XRD圖譜Fig.7 XRD of BC produced from basic medium(BC-DZ) and BC from pomace hydrolysate (BC-YP)

兩種樣品的結晶度與晶體粒徑的結果如表4所示。結果表明,BC-YP 和BC-DZ的結晶度基本相同,均為24%左右,BC-YP 粒徑大于BC-DZ。結晶度與纖維的抗張強度、楊氏模量、硬度、伸長率、吸濕性、潤脹度、柔軟性等性質有一定的關系[20-21],說明蘋果渣水解液作為發酵原料不影響BC結晶度。晶體粒徑與透明度、撕裂因子有關,蘋果渣水解液中含有纖維素未水解完全的多糖成分,部分多糖可在BC合成過程中結合到BC中,從而改變BC的晶體粒徑。

表4 基本培養基發酵BC(BC-DZ)與蘋果渣水解液發酵BC(BC-YP)XRD結果

注:BC-DZ-基本培養基發酵BC;BC-YP-蘋果渣水解液發酵BC。

3 結論

通過單因素實驗和響應面法對蘋果渣水解液發酵生產BC的發酵培養基進行優化,建立了蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂和黃嘌呤4個因素對BC產量的二次回歸方程模型,經檢驗,模型準確有效,可以用該模型分析預測各因素對BC產量的影響。由單因素實驗和響應面優化模型確定利用蘋果渣水解液發酵生產BC的最佳發酵培養基為:蔗糖38.44 g、蛋白胨10.91 g、硫酸鎂0.85 g、黃嘌呤0.87 g、乙醇10 mL、蘋果渣水解液1000 mL、pH6.0。在此條件下,得到BC產量為7.19 g/L,較優化前(5.65 g/L)提高了27.3%。利用FT-IR及XRD對發酵產物BC化學基團、結晶性能進行了比較,結果表明,蘋果渣水解液發酵產物BC結構性能與基本培養基發酵產物BC基本一致,蘋果渣水解液能夠替代部分發酵原料發酵生產BC,且不影響BC性能。

[1]Sybele S,Lucas N T,Paulo T O,et al. Bacterial cellulose-collagen nanocomposite for bone tissue engineering[J]. J. Mater. Chem,2012,22,22102-22112.

[2]Cai Zhi-jiang,Yang Guang. Bacterial Cellulose/Collagen Composite:Characterization and First Evaluation of Cytocompatibility[J]. J. Appl. Polym. Sci.,2011,120,2938-2944.

[3]趙思雨,陳仕艷,王華平. 細菌纖維素的生產及其在食品工業中的應用[J]. 湛江師范學院學報,2013,34(6):69-72.

[4]楊福有,祁周約,李彩風楊,等. 蘋果渣營養成分分析及飼用價值評估[J]. 甘肅農業大學學報,2000,35(3):340-344.

[5]Sargent S A.An energy and cost analysis modelto evaluate the combustion of food processing wastes[D].Ph.D. Thesis,Department of Agriculture Engineering,Michigan State University,E. Lansing,MI. 1984.

[6]李彩鳳,楊福有. 蘋果渣的營養成分及利用[J].飼料博覽,2001(2):38

[7]Joshi V K,Sandhu D K.Properation and Evaluation of Animal Feed Byproduct Produced by Solid-State Fermentation of Apple Pomace[J]. Bioresource Technology,1996,56:251-255.

[8]Joshi V K,Gupta K.Production and evaluation off ermented apple pomace in the feed of broilers[J].Journal of Food Science and Technology,2 000,37(6):609-612.

[9]Sandhu D K,Joshi V K. Solid state fermentation of apple pomace for concentation of ethanol and animal feed[J]. Jounral of Science &Industrial Research,1997,56(2):86-90.

[10]史紅兵,宋紀蓉,黃潔,等. 果渣制備可溶性膳食纖維的工藝研究[J].西北大學學報(自然科學版),2004(4):148-152.

[11]張雯,齊香君. 細菌纖維素生產菌株菌體細胞收集方法的研究[J]. 食品工業科技,2006,27(9):57-58.

[12]Chao Y,Ishida T Y,Shoda M. Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum in a 50-L internal-loop airlift reactor[J].Biotechnology Bioeng,2000,68:345-352.

[13]Putra A,Kakugo A,Furukawa H,et al. Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface[J]. Polymer,2008,49:1885-1891.

[14]Son HJ.,Kim HG.,Kim KK.,et al. Increased production of bacterial cellulose by Acetobacter sp V6 in synthetic media under shaking culture conditions[J]. Bioresource Technology,2003,86(3),215-219.

[15]章國燕,張奕華. 選擇性磷酸二酯酶Ⅳ抑制劑的研究[J].藥學進展,2002,26(2):86-91.

[16]Sarya A,Pierre D,Selim K. Lipase-catalyzed transesterification of krill oil and 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid in solvent-free medium using response surface methodology[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2012,84(212):189-197.

[17]張麗平,盧紅梅,彭湘屏,等. 淋澆發酵法生產細菌纖維素的結構與性質研究[J]. 食品工業科技,2012,33(22):197-201.

[18]Rajalaxmi D,Marcus F,Arthur J R. Improving the mechanical and thermal properties of gelatin hydrogels cross-linked by cellulose nanowhiskers[J]. Carbohydrate Polymers,2013(91):638-645

[19]Pei Ying,Yang Juan,Liu Pan,et al. Fabrication,properties and bioapplications of cellulose-collagen hydrolysate composite films[J]. Carbohydrate Polymers,2013,92:1752-1760.

[20]Saska S,Barud H S,Gaspar A M M,et al. Bacterial Cellulose-Hydroxyapatite Nanocomposites for Bone Regeneration[J]. International Journal of Biomaterials,2011,5(5):1605-1613.

[21]馮勁,施慶珊,馮靜. 不同干燥方式對細菌纖維素物理性能的影響[J],現代食品科技,2013,29(9):2225-2101.

Optimization of medium for bacterial cellulose fermentation with pomace by response surface methodology and property studies of the product

ZHANG Wen1,LI Hong-Jie2,LIU Lan1,QI Xiang-Jun1

(1.School of Food and biological engineering,Shaanxi University of Science & Technology,Xi’an 710021,China；2.Huadong Pharmaceutical Co.,Ltd.,Hangzhou 311000,China)

In order to increase the bacterial cellulose(BC)productivity ofAcetobacterxylinumusing pomace hydrolysate,response surface methodology was used to optimize the fermentation medium. Meanwhile,the properties of BC were compared through fourier transform infrared(FT-IR)and X-ray diffraction(XRD). According to the results of single factor experiments and response surface experiments,the optimal fermentation medium were determined as follows:saccharose 38.44 g,peptone 10.91 g,magnesium sulfate 0.85 g,xanthine 0.87 g,ethanol 10 mL,pomace hydrolysate 1000 mL and pH6.0,under these conditions,the BC productivity was 7.19 g/L,increased by 27.3% in comparision to before(5.65 g/L). The properties and structures of BC produced with pomace hydrolysate were confirmed to be basically same with BC produced with basic medium,which indicated that the pomace hydrolysate could be used as part of raw materials to ferment BC and would not affect the properties of BC.

pomace;bacterial cellulose;medium optimization;response surface methodology

2015-03-12

張雯(1982-)，女，博士，副教授，研究方向:生物制藥，E-mail:zwen102@163.com。

陜西省科技廳自然基金項目(2012JM2005)；陜西省教育廳科研專項項目(15JK1108)；2013年國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201310708014)；西安市科技計劃項目(CXY1513(3))。

TS201.1

B

1002-0306(2015)23-0228-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.039