采后藍莓果實表面病原菌的分離鑒定及PCR檢測

白 雪,姜愛麗,*,胡文忠,何煜波,馮 可

(1.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

采后藍莓果實表面病原菌的分離鑒定及PCR檢測

白 雪1,姜愛麗1,*,胡文忠1,何煜波1,馮 可2

(1.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600;2.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

以采后貯藏過程中自然腐敗變質的藍莓果實為材料,采用傳統純培養法和平板劃線法對藍莓果實表面致腐優勢菌進行了分離與形態學鑒定,最終確定葡萄孢霉(Botrytiscinema)為主要病原菌。采用基因組DNA提取試劑盒法提取葡萄孢霉的DNA,并篩選具有特異性的引物,通過聚合酶鏈式反應(PCR)對葡萄孢霉特定的DNA片段進行擴增,得到具有特異性的目的基因,對其進行分子生物學的特異性鑒定,并對其檢測條件進行優化。最終得到具有特異性的引物序列為BcF-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC;BcR-TTGAAATGCGATTAATTGTTGC,最適的擴增引物濃度為0.25 μmol/L,PCR擴增的最適退火溫度為 60 ℃。該方法可有效提高藍莓病原菌的檢測效率,可將其應用于實踐中,為藍莓的貯藏保鮮提供理論依據和技術指導。

藍莓,病原菌,葡萄孢霉,PCR檢測,分離鑒定

藍莓甜酸適口,營養成分豐富,是世界糧農組織推薦的五大健康水果之一,其富含熊果甙、花青素等其他果品中少有的營養成分,果實制品具有延緩老化[1]提高抵御DNA損傷[2],解除眼睛疲勞并提高視力,增強心臟功能[3]等多方面的功效。

藍莓貯藏過程中的腐爛現象一直是制約藍莓產業發展的主要問題,而藍莓果實病原菌的侵染又是導致其腐爛的最主要原因。目前,相關藍莓病原菌的研究大都是對其主要病原菌進行了形態學的初步分類與鑒定,而對其病原菌進行特異性分子生物學鑒定的研究很少。葡萄孢霉(Botrytis cinema)又稱灰霉菌[4],是危害花卉、水果、蔬菜等多種經濟作物的優勢病原菌,經Hahn等[5]和陳長卿等[6]研究發現引起采后藍莓腐敗變質的主要病原菌是葡萄孢霉,馮璐等[7]和Sanzani等[8]也采用傳統的方法對葡萄孢霉進行了形態學的初步分離與鑒定,但并未對其進行分子生物學層面的鑒定。

大連地區是栽培藍莓的主產區,近年來鮮食藍莓的產量逐年上升。盡管Hahn等[5]和陳長卿等[6]研究發現引起采后藍莓腐敗變質的主要病原菌是葡萄孢霉,但大連地區主栽藍莓品種的病原菌種類和防治方法未見相關報道。鑒于此,本研究不僅對引起大連地區鮮食藍莓主栽品種腐敗變質的病原菌進行了分離,還對其進行初步的形態學鑒定,分離到葡萄孢霉為主要病原菌。而且對葡萄孢霉的特異性進行鑒定,并進一步對其PCR鑒定條件進行優化,確保得到更清晰快速的檢測結果,為藍莓采后保鮮及病原菌的檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓果實 大連南北藍莓科技發展有限公司藍莓園,500 g為一個樣本,取10個樣本。采后立即運到實驗室,4 ℃貯藏備用。葡萄糖,瓊脂粉 國產分析純;DNA植物kit基因組織提取試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司。

DYY-11型電泳儀電源、DYCP-31F型電泳儀 北京市六一儀器廠;TC-512型PCR儀 Techne公司;BioSpectrum 310凝膠成像系統 美國UVP公司;BR4i型臺式高速冷凍離心機 法國Jouan公司;超凈工作臺2HJH-C2112B 上海智城分析儀器制造有限公司。

依據Celik M[9]、Gachon C[10]的研究,實驗所需兩對引物由寶生物工程(大連)有限公司設計合成,配對引物序列:BcF-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC;BcR-TTGAAATGCGATTAATTGTTGC;FHel81-AC AGACTTTGGGCACATTCC,RHel82-TGTAATTTCAA TGTGCAGAATCC。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌分離純化 用混菌法分離病原菌,制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5CFU/mL各個梯度稀釋的菌液,放置恒溫培養箱中培養。待菌落長出,用平板劃線法,連續培養3～5次,使其在培養基上出現單菌落,從而達到對藍莓表面病原菌進行分離純化的目的[11]。

1.2.2 回接實驗 將分離純化得到的病原菌回接到無病蟲害的新鮮藍莓上,參照范青等[12]的方法:將新鮮、無病害、無機械傷的藍莓用酒精消毒,晾干后,用滅菌鐵釘在每個果實腰部刺孔(3 mm深×3 mm寬),在孔內接種一定濃度(3×106CFU/mL,0.1 mL)的菌液,將接種后果實放入經紫外燈照射30 min的塑料托盤中,薄膜包裝后放在25 ℃下保濕培養,定期觀察發病狀態。

1.2.3 病原菌DNA的提取 用寶生物工程(大連)有限公司提取試劑盒提取。

1.2.4 引物篩選 在體系中分別加入兩種引物,在各自所需條件下進行PCR反應,觀察結果。

1.2.5 PCR反應體系中引物濃度優化 選取已經篩選成功的PCR反應的特異性引物,作為工作液。PCR體系主要包括:每50 μL PCR反應液中Ex Taq酶(5 U/μL)0.3 μL,10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free)5 μL,MgCl2(25 mmol/L)的加入量為4 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)的加入量是4 μL,模板DNA溶液的加入量是3 μL,篩選出的具有特異性的上下游引物,依據先前致腐菌PCR實驗的研究比對,采用較為合適的實驗方法[13],引物濃度分別為1,0.4,0.25,0.2,0.15 μmol/L。上下游引物添加量分別為1 μL,將剩余體系體積用雙蒸水補足。反應條件為:預變性溫度95 ℃,時間持續2 min;變性的溫度是94 ℃,時間15 s,60 ℃退火15 s,整個過程重復35次,延伸溫度是72 ℃,時間10 min,產物4 ℃保存[14-15]。

1.2.6 PCR反應體系中退火溫度的優化 選取已經篩選成功的PCR反應特異性引物,按照優化后的引物濃度,每50 μL PCR反應體系中加入 Ex Taq 酶(5 U/uL)0.3 μL,10×Ex Taq Buffer(Mg2+Free)5 μL,MgCl2(25 mmol/L)的加入量為4 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)的加入量是4 μL,模板DNA溶液的加入量是3 μL,上下游引物各1 μL,將剩余體積用雙蒸水補足。反應條件為:預變性溫度95 ℃,時間持續2 min;變性的溫度是94 ℃,時間15 s,退火溫度53 ℃[16-17],并設置梯度退火實驗,55、60、65 ℃進行退火溫度優化實驗,退火時間15 s,整個過程重復35個循環,延伸溫度是72 ℃,時間10 min,產物4 ℃保存[18]。

1.2.7 PCR產物電泳分析 PCR體系反應結束后,從獲得的體系中分別取出體積為10 μL的PCR產物,并將0.5 g瓊脂糖粉末倒入50 mL的TAE緩沖液中,同時加入GelRed染料,煮開兩次,得到濃度為1%的膠版,將電泳條件設定為電壓U=95 V,電流I=400 mA,時間T=1 h,整個電泳過程結束后,經凝膠成像分析系統成像。

2 結果與分析

2.1 菌落分離純化結果

按梯度稀釋法獲得的結果,通過平板劃線法得到單菌落,培養后僅得到一種優勢菌株,依據其培養基狀態特征,判斷其類別,并采用插片鑒定法[19]進行形態鑒定。

分離到的病原菌在PDA培養基上的菌落形態(圖1):菌落呈絨狀,菌絲體初為白色,后形成灰色霉層,而顯微鏡下觀察到孢子梗頂端不膨大,排列成帚狀的間枝,分生孢子串呈不分枝的鏈狀(圖2)。

圖1 病原菌在培養基狀態Fig.1 Pathogens on PDA

圖2 病原菌在顯微鏡下狀態Fig.2 Pathogens in the microscope

通過與真菌鑒定手冊[20]所描述的形態比對,發現此真菌菌落特征與葡萄孢霉的特點相符,初步判定是葡萄孢霉。

2.2 回接實驗結果

回接實驗證明,病原菌對藍莓果實具有很強的致病性,基本確定其為葡萄孢霉。

圖3 病原菌回接實驗Fig.3 Pathogen infection experiment

2.3 PCR引物篩選結果

由圖4反應結果可知,特異性引物BcF-TGTAA TTTCAATGTGCAGAATCC;BcR-TGAAATGCGATTAA TTGTTGC擴增出特定的大小為90 bp的目的基因;FHel81-ACAGACTTTGGGCACATTCC,RHel82-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC未獲得特異性的PCR產物,所以引物BcR/BcF具有特異性,BcR/BcF這一對特異性引物可以作為進一步實驗的反應引物。

圖4 PCR引物篩選結果Fig.4 The different primer of PCR amplification products注:M:Maker500;1～2:BcR/BcF引物擴增產物結果;3～4:FHel81/FHel82引物擴增產物結果。

圖5 相對遷移率與目的基因對數相關性關系Fig.5 Relationship between relative mobility and genes size

由于目的基因太小,沒有小于100 bp的maker與之匹配,所以通過相對遷移率標準曲線來驗證所獲得的目的基因的大小。通過標準曲線的對比,得到目的基因的大小為90 bp。

2.4 PCR引物濃度優化結果

引物濃度為1 μmol/L和0.4 μmol/L的PCR反應結果類似,幾乎看不到目的基因,引物濃度為0.2 μmol/L和0.15 μmol/L的PCR反應結果類似,目的基因不太清晰。實驗中引物濃度為0.25 μmol/L的PCR反應結果較為清晰,特異性更強,這一體系添加標準可以被用于繼續的實驗中。

圖6～圖8分別是引物濃度為0.4,0.2,0.25 μmol/L的PCR反應結果。

圖6 PCR引物濃度為0.4 μmol/L的結果Fig.6 PCR results of Primer diluted to 1 μmol/L注:M:Marker500;1～3:擴增結果，圖7、圖8同。

圖7 PCR引物濃度稀釋為0.2 μmol/L的結果Fig.7 PCR results of Primer diluted to 0.2 μmol/L

圖8 PCR引物濃度稀釋為0.25 μmol/L的結果Fig.8 PCR results of Primer diluted to 0.25 μmol/L

2.5 PCR退火溫度優化結果

圖9是退火溫度為53 ℃的PCR反應結果,圖10是退火溫度為55、60、65 ℃的梯度退火PCR反應結果,圖9幾乎看不到特異性引物BcR/BcF擴增出的目的基因。圖10中可以看出最合適的退火溫度為60 ℃。

圖9 PCR退火溫度為53 ℃的結果Fig.9 Annealing temperature 53 ℃ results注:M:Maker500;1～3:53 ℃結果。

圖10 PCR梯度退火的結果Fig.10 Annealing temperature result注:M:Maker500;1～3:60 ℃,4～6:65 ℃,7～9:55 ℃。

3 結論與討論

果實成熟后感染葡萄孢霉會導致其在運輸和貯藏過程中大量腐爛,嚴重影響其采后保鮮。對于藍莓而言,從源頭發現染病果實并及時挑選處理對減少其貯藏損失尤為重要。本實驗分離篩選出的引起采后藍莓腐敗變質的主要病原菌為葡萄孢霉,采用PCR技術對葡萄孢霉進行了特異性分子生物學鑒定,并對其鑒定條件及操作方法進行了優化實驗,得到最具特異性的引物序列為BcF-TGTAATTTC AATGTGCAGAATCC;BcR-TTGAAATGCGATTAA TTGTTGC,最合適的引物濃度為0.25 μmol/L,最合適的退火溫度為60 ℃。

本研究利用了PCR技術,建立了一種敏感準確的檢測方法,利用PCR技術對藍莓表面病原菌進行檢測,可以使其病原菌DNA得以迅速擴增,靈敏度高、省時有針對性,利用在實際中可以大大提高檢測的效率及準確率,本方法為今后藍莓采后貯藏提供技術支持和理論基礎,具有較好的應用前景。

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Study on the optimization of PCR detection conditions for pathogen isolated from the postharvest blueberry surface

BAI Xue1,JIANG Ai-li1,*,HU Wen-zhong1,HE Yu-bo1,FENG Ke2

(1.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;2.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

The main pathogens were separated and identified from the rotting postharvest blueberry fruits using traditional pure culture method and plate streaking method. The results showed that the main pathogen wasBotrytiscinerea. In order to identifyBotrytiscinereawith PCR method and found its best experimental conditions,the Genomic DNA was extracted and the target gene was screened with specific primers. The optimum PCR experimental condition was as following:the primer sequences were BcF-TGTAATTTCAATGTGCAGAATCC and BcR-TTGAAATGCGATTAATT GTTGC,the best amplification primer concentration was 0.25 μmol/L,the optimal annealing temperature was 60 ℃. This PCR method could effectively improve the detection efficiency of blueberry pathogens. Moreover,it helped to set up a theoretical basis and technical guidance for the preservation of blueberries in production.

blueberry;pathogen;Botrytiscinerea;PCR detection;isolation and identification

2015-03-27

白雪(1991-)，女，本科，研究方向：食品科學，E-mail:597764245@qq.com。

*通訊作者:姜愛麗(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學，E-mail:jal@dlnu.edu.cn。

國家國際科技合作項目(2013DFA31450)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05)。

TS201.7

A

1002-0306(2015)23-0297-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.053