乙酰化黑木耳多糖的制備及其抗氧化活性研究

楊春瑜,楊春莉,劉海玲,景志剛,徐曉鑫,王田慧

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院黑龍江省食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;2.哈爾濱商業大學輕工學院,黑龍江哈爾濱150028;3.黑龍江省玄鳥生物科技股份有限公司,黑龍江哈爾濱 150000)

乙酰化黑木耳多糖的制備及其抗氧化活性研究

楊春瑜1,楊春莉2,劉海玲1,景志剛1,徐曉鑫3,王田慧1

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院黑龍江省食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;2.哈爾濱商業大學輕工學院,黑龍江哈爾濱150028;3.黑龍江省玄鳥生物科技股份有限公司,黑龍江哈爾濱 150000)

本實驗采用二次回歸正交組合設計法優化了乙酰化黑木耳多糖的制備工藝,并對乙酰化前后黑木耳多糖的抗氧化活性進行了比較研究。實驗以甲酰胺為溶劑,乙酸酐為酰化試劑,N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)為催化劑,采用二次回歸正交組合設計法,以反應時間、反應溫度、酰化試劑用量和NBS添加量為實驗因素,采用羥胺比色法測定乙酰取代度的大小,以乙酰化取代度大小為實驗指標,利用SPSS軟件進行數據分析。結果表明,酰化試劑用量和NBS添加量對黑木耳多糖乙酰化有顯著影響(p<0.05),經過方程運算,得到制備乙酰化黑木耳多糖的最優實驗條件為,反應時間3.5 h,反應溫度80.0 ℃,乙酰化試劑用量32.5 mL,NBS添加量為1.0%,在此實驗條件下,得到的乙酰化取代度平均值為0.55。通過對原多糖和乙酰化多糖的紅外光譜檢測,顯示乙酰化黑木耳多糖制備成功。抗氧化活性研究結果顯示,黑木耳多糖乙酰化改性后清除羥自由基和超氧陰離子自由基的能力有所增加;還原能力也要比原料多糖有所提高。

黑木耳多糖,乙酰化,紅外光譜(IR),抗氧化活性

真菌中多糖具有抗腫瘤,抗氧化,降血脂,降血糖和增強免疫等作用[1]。影響多糖活性的因素包括多糖的主鏈性質、支鏈性質和多糖分子的高級結構[2]。為了更好的發揮多糖的活性,對多糖分子進行修飾和結構改造具有重要意義[3]。多糖的乙酰化是一種重要的多糖支鏈修飾方法,乙酰基能使多糖的伸展發生變化,導致多糖羥基暴露,增加多糖在水中的溶解度,從而改善多糖的生理活性,使多糖得到有效利用[4]。多糖的活性與多糖的結構、分子量、溶解性等諸多因素緊密相關。但是多糖的衍生化也有使原有活性減弱或喪失,因此多糖的衍生化關鍵在于確定多糖的結構與活性關系,確保多糖在衍生化后活性中心的立體構象處于最佳狀態[5]。天然多糖是一種多羥基的化合物,這些羥基均為活性基團,在適當環境中,它們可被親核基團或親核化合物取代,而發生親核取代反應,生成相應的多糖酯。多糖乙酰化反應,實質上是多元醇與酸發生的酯化反應[6],其酯化反應機理如見圖1:

表1 因素上下水平及因子編碼

注:Z1=x1Δ1+Z01;Z2=x2Δ2+Z02;Z3=x3Δ3+Z03。

圖1 多糖酯化反應機理Fig.1 Reaction mechanism of polysaccharide esterification

另外,羥自由基和超氧陰離子等自由基,與炎癥等疾病有著密切的關系[7]。大量研究表明,黑木耳多糖具有體外抗氧化活性[8],本文主要對黑木耳多糖進行乙酰化修飾,并對其體外抗氧化活性進行比較。從而為開發出更利于人類健康的產品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 產于黑龍江省牡丹江林口地區;鹽酸羥胺、氫氧化鈉、濃鹽酸、三氯化鐵、乙酸酐、正丁醇、氨水、檸檬酸、丙酮、活性炭、三氯甲烷、過氧化氫、磷酸氫二鈉、無水乙醇、甲酰胺、3600 u透析袋、N-溴代琥珀酸亞胺(NBS)、番紅花、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、雙氧水、乙二胺四乙酸鐵鈉(EDTA-Fe)、鄰苯三酚、Tris、HCl、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純,實驗用水均為蒸餾水。

高轉速離心機 北京醫用離心機廠;ESJ120-4電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器公司;多功能搖擺粉碎機 上海市新亞凈化器件廠;721E型可見光光度計 上海天美科學儀器有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器 上海南江電汎器材廠;DK-98-I型電子恒溫水浴 天津泰斯特儀器公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司、傅立葉變換紅外光譜儀 北京備份瑞利分析儀器有限公司;UV-5100B型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取 根據同一個課題組前期的研究[9],確定黑木耳多糖提取的最優條件為溫度80 ℃、時間5.5 h、料液比1∶110、pH5.5。根據同一課題組前期研究得到工藝流程[10]如下:

黑木耳粉→去脂→浸提→上清液→4100 r/min離心30 min→上清液→測糖含量→Sevag法[11]除蛋白→活性炭脫色→95%乙醇沉淀→丙酮沉淀→離子交換→濃縮干燥

1.2.2 乙酰化黑木耳多糖的制備 稱取2.000 g黑木耳多糖溶于80 mL甲酰胺中,恒溫攪拌一定時間,滴加相應體積的乙酸酐(含1% NBS,提前溶于乙酸酐中),恒溫攪拌反應,反應結束后測乙酰取代度。85%的乙醇沉淀;用95%乙醇洗滌沉淀1～2次。將沉淀溶于10～20 mL蒸餾水中。3600 u透析袋蒸餾水透析2 d,減壓濃縮,冷凍干燥,由IR檢測乙酰化是否成功[12-13]。

1.2.3 二次回歸正交組合設計實驗 以反應時間、反應溫度、乙酰化試劑用量,NBS添加量四個因素進行考察,對四個因素進行單因素實驗,比較實驗結果,選擇主要影響乙酰化效果的水平做二次回歸正交組合設計實驗,對結果進行方差分析,確定黑木耳多糖乙酰化最好的工藝條件。

1.2.4 乙酰取代度的測定方法 采用羥胺比色法[14]測定黑木耳多糖的乙酰取代度,是利用強堿條件下游離出來的乙酰基與羥胺反應生成乙酰肟羥酸,再與Fe3+生成可溶性紅色絡合物羥肟酸鐵,即可利用分光光度計進行乙酰取代度測定;該法較為簡便快捷、靈敏度高,適用范圍較廣。

1.2.4.1 乙酰基含量標準曲線的制備β-D-五乙酰葡萄糖儲備液的配制:精密稱取β-D-五乙酰葡萄糖(分子量390.34 u)0.6978 g,置100 mL量瓶中,加20 mL乙醇于60 ℃水浴加熱溶解后,冷卻至室溫,再加水稀釋至刻度,搖勻后即得。儲備液中乙酰基(分子量 43.05 u)濃度按對照品的55.14%計,為3.848 mg/mL。β-D-五乙酰葡萄糖系列標準溶液的配制:精密吸取β-D-五乙酰葡萄糖對照品儲備液2、4、6、8、10、12 mL,分別置 50 mL 容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻即得,依次標記為1～6號對照品溶液。最大吸收波長測定:以三氯化鐵為顯色劑,以水做空白對照,用紫外吸收分光光度計對生成的棕色絡合物進行全波長掃描。確定最大吸收波長之后,精密吸取1～6號對照品溶液5 mL于50 mL容量瓶中,照方法,于最大波長處(500 nm)處測定吸收度值(A)。以乙酰基的濃度(C,mg·mL-1)為橫坐標,吸收度 A為縱坐標作圖。

1.2.4.2 乙酰基最大吸收波長的確定 精密吸取4號0.62 mg·L-1標準液5 mL 于 50 mL 容量瓶中,照“1.2.4.1”項下方法,取該溶液2.5 mL,置于1 cm石英比色皿中,作為對照品溶液;以相同量的去離子水代替多糖,作為空白溶液,在200～800 nm的波長范圍內掃描。

1.2.4.3 樣品乙酰取代度的測定方法 樣品溶液配制:精密稱取乙酰化黑木耳多糖0.02901 g,置10 mL容量瓶中,加水適量,置60 ℃水浴上加熱溶解,待完全溶解后冷卻至室溫,再加水定容,即得。

樣品測定步驟:精確吸取一定量的多糖溶液于50 mL棕色容量瓶中,準確加入0.1 mol·L-1新配制鹽酸羥胺溶液5 mL,加入1.5 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL,混勻,靜置20 min后,加入2 mol·L-1鹽酸3.5 mL以中和過量的堿,混勻后靜置20 min,滴加0.37 mol·L-1三氯化鐵溶液10 mL混勻,用去離子水定容,靜置10 min后,取2.5 mL,置1 cm石英池中,作為供試品溶液。另以相同量的去離子水代替多糖溶液同法操作,作為空白,一定時間內測定吸收度。

1.2.4.4 乙酰取代度計算方法 乙酰取代度度是指平均每個失水葡萄糖單元上被乙酰基取代的羥基數目,具體數值按以下公式得出:

W2(%)=W2/W1×100

式(1)

式(2)

式中:W1-多糖的質量(mg),W2-多糖中乙酰基的質量(mg),162-乙酰化黑木耳多糖中一個單糖基相對分子質量,43-乙酰基相對分子質量,1-氫原子的相對原子質量。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 反應時間對黑木耳多糖乙酰化的影響 將2.000 g樣品溶于80 mL的甲酰胺中,加入32.5 mL的乙酰化試劑(含有1%NBS的乙酸酐)在80 ℃下,分別反應2、3、4、5、6 h。反應結束后,將乙酰化多糖干燥后,測乙酰取代度。

1.2.5.2 反應溫度對黑木耳多糖乙酰化的影響 將2.000 g樣品溶于80 mL的甲酰胺中,加入32.5 mL的乙酰化試劑(含有1%NBS的乙酸酐)在20、40、60、80、100 ℃下,分別反應4 h。反應結束后,將乙酰化多糖干燥后,測乙酰取代度。

1.2.5.3 乙酰化試劑用量對黑木耳多糖乙酰化的影響 將2.000 g樣品溶于80 mL的甲酰胺中,分別加入15、23.75、32.5、41.25、50.00 mL的乙酰化試劑(含有1% NBS的乙酸酐)在80 ℃下,分別反應4 h。反應結束后,將乙酰化多糖干燥后,測乙酰取代度。

1.2.5.4 NBS添加量對黑木耳多糖乙酰化的影響 將2.000 g樣品溶于80 mL的甲酰胺中,加入分別含有0.5%、1%、1.5%、2%、2.5% NBS的32.5 mL乙酰化試劑,在80 ℃下,分別反應4 h。反應結束后,將乙酰化多糖干燥后,測乙酰取代度。

1.2.6 紅外光譜檢測 利用二次回歸正交組合設計實驗得到的最優實驗方案,制備乙酰化黑木耳多糖。取10 mg左右的黑木耳多糖、乙酰化黑木耳多糖,用 KBr 研磨壓片后,在4000～400 cm-1范圍內進行掃描。

清除率(%)=(A樣品-A空白)/A對照×100

式(3)

清除率(%)=(ΔAo-ΔA)/(ΔAo)×100

式(4)

式中,ΔAo為鄰苯三酚自氧化速率,ΔA 為加入多糖溶液后,鄰苯三酚的自氧化速率,單位均為吸光度每分鐘的增加值。

1.2.9 還原能力 在不同濃度的樣品 1.25 mL(0.5～4.0 mg/mL)中,加入磷酸緩沖液(0. 2 mol/L pH6. 0)配制的1%(w/v)的鐵氰化鉀1.25 mL,在50 ℃下保溫20 min,用1. 25 mL三氯乙酸(10%,w/v)終止反應,5 min后加入1. 5 mL 0. 1%三氯化鐵,室溫放置30 min,700 nm下測定吸光度,吸光度越大,還原能力越強[19-20]。

1.3 數據處理分析方法

本文采用SPSS數據處理軟件,對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 乙酰基最大吸收波長的確定

如圖2結果顯示在200～800 nm可見光波長處測定時,對照品溶液在500 nm波長處最大吸收,相應的空白溶液干擾小,故選用500 nm為測定波長。

圖2 β-D-五乙酰葡萄糖的紫外吸收圖譜Fig.2 Acetyl β-d-glucose byUV absorption spectrum

2.2 乙酰基標準曲線

以乙酰基的濃度(C,mg·mL-1)為橫坐標,吸收度A為縱坐標作圖。

如圖3,得到乙酰基標準曲線為Y=14.178x+0.0589,R2=0.9909。表明,乙酰基濃度在0.01～0.1 mg·mL-1范圍內,吸收度與濃度呈良好的線性關系。

圖3 乙酰基標準曲線Fig.3 Acetyl standard curve

2.3 單因素及二次回歸組合正交實驗

2.3.1 反應時間對黑木耳多糖乙酰化效果的影響 由圖4可知,乙酰取代度開始隨反應時間的增加而增加,當反應4 h時,乙酰取代度的值最大,乙酰化效果最好;此時乙酰化試劑與黑木耳多糖恰好反應完全,當反應時間繼續增加時,乙酰取代度開始減少,可能是由于,反應時間過長,使一部分乙酰化多糖的乙酰基游離出來,導致取代度降低,隨后隨時間的延長,乙酰基又與多糖集合,乙酰度又開始增大。因此,選擇3～5 h進行后續優化實驗。

圖4 反應時間對黑木耳多糖乙酰化的影響Fig.4 Effect of reaction time on polysaccharide acetylated of Auricular auricularia

2.3.2 反應溫度對黑木耳多糖乙酰化效果的影響 由圖5可知,乙酰化取代度開始隨反應溫度的增加而增大,80 ℃時,乙酰取代度最大,乙酰化效果最好,此時的溫度能夠使乙酰基與多糖緊密結合;當反應溫度繼續增加時,乙酰取代度開始降低,溫度過高的同時會降低乙酰基與多糖的結合力,并且溶液開始產生副反應物,出現明顯的黃色,不利于乙酰化多糖的制備。因此,選擇溫度為60～100 ℃進行后續實驗。

圖5 反應溫度對黑木耳多糖乙酰化的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on polysaccharide acetylated of Auricular auricularia

2.3.3 乙酰化試劑用量對乙酰化效果的影響 由圖6可知,乙酰取代度隨反應時間的增加而增加,乙酰化試劑添加量為32.5 mL時,乙酰取代度最大,乙酰化效果最好,此時乙酰化試劑與黑木耳多糖反應完全;當乙酰化試劑繼續增加時,生成物乙酰化多糖對該反應起到抑制作用,乙酰取代度開始降低。因此,當乙酰化試劑添加量為32.5 mL時,乙酰化黑木耳多糖的效果最好。

圖6 乙酰化試劑添加量對黑木耳多糖乙酰化的影響Fig.6 Effect of acetylated reagent addition on polysaccharide acetylated of Auricular auricularia

2.3.4 NBS添加量對乙酰化效果的影響 由圖7可知,乙酰取代度隨NBS添加量的增加而增加,NBS作為一種催化劑,NBS添加量為1%時,乙酰取代度最大,乙酰化效果最好,當NBS繼續增加時,反應溶液黏度逐漸增加,影響溶液中乙酰化試劑與多糖的充分反應,乙酰取代度開始降低。因此,當NBS添加量為1%時,乙酰化黑木耳多糖的效果最好。

圖7 NBS添加量對黑木耳多糖乙酰化的影響Fig.7 Effect of NBS addition on polysaccharide acetylated of Auricular auricularia

2.3.5 二次回歸組合正交實驗設計及結果 在單因素的基礎上,選擇乙酰取代度較高的反應時間,反應溫度,乙酰化試劑用量,NBS添加量四個因素進行二次回歸組合正交實驗。二次回歸組合正交設計與結果見表2。方差分析結果如表3和表4。其中y是乙酰化取代度,乙酰化取代度值越大,說明參加反應的乙酸酐的量越多[21-22]。

表2 乙酰化黑木耳多糖制備二次回歸組合正交實驗設計及結果

表3 方差分析

表4 系數α

對實驗數據進行處理[23-24],乙酰化試劑用量和NBS添加量對黑木耳多糖乙酰化有顯著影響(p<0.05)。得到回歸方程,Y=0.430+0.018x1+0.017x2+0.033x3+0.044x4+0.037x1x2-0.013x1x3+0.012x1x4+0.05x2x3-0.07x2x4+0.014x3x4。

對x1、x2、x3、x4求導,Z1=x1Δ1+Z01;Z2=x2Δ2+Z02;Z3=x3Δ3+Z03;得到最優方案為溫度80.223 ℃、時間3.571 h、乙酸化試劑32.532 mL、NBS添加量為1.031%。為檢驗二次回歸正交法所得結果的可靠性采用上述優化提取條件進行乙酰化黑木耳多糖的制備,考慮到實際操作的便利,將提取工藝參數修正為溫度80.0 ℃、時間3.5 h、乙酸化試劑32.5 mL、NBS添加量為1.0%。以上述條件進行實驗結果的驗證,重復3次實際測得的乙酰化黑木耳多糖取代度為分別得到0.57、0.49、0.58,三次實驗平均取代度為0.55。說明通過二次回歸正交優化后得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。然后對乙酰化黑木耳多糖進行紅外光譜分析與原多糖紅外光譜進行對比。

2.4 乙酰化黑木耳多糖與原多糖的紅外光譜分析結果

黑木耳多糖的紅外光譜,如圖8,在1620～1630 cm-1附近顯示出多糖的特征吸收。表明所得物即為黑木耳多糖。不難看出,乙酰化黑木耳多糖在1732. 81 cm-1處出現了一個吸收峰,為酯基C=O雙鍵的伸縮振動,1260.80 cm-1處有一個酯基C—O的伸縮振動,說明乙酰化衍生物中已成功加入了乙酰基。乙酰化黑木耳多糖和原料多糖的IR譜圖相比,表明樣品的乙酰化是成功的[25]。

圖8 乙酰化黑木耳多糖和原料黑木耳多糖的紅外光譜圖Fig.8 IR spectrum of Auricularia auricula acetylated polysaccharide and Auricularia auricula polysaccharide

2.5 樣品對羥自由基(·OH)的清除作用

由圖9可知,乙酰化黑木耳多糖清除羥自由基的能力均大于原料多糖,當濃度為1.5 mg·mL-1和3.5 mg·mL-1時清除率大于50%。可見,當黑木耳多糖乙酰化后其清除羥自由基的能力得到了很大的提高。

圖9 乙酰化黑木耳多糖清除羥自由基的能力Fig.9 Acetylated Auricularia auricula polysaccharide removing hydroxyl free radical ability

由圖10可見,不同濃度下黑木耳多糖與乙酰化黑木耳多糖均有清除超氧陰離子自由基的能力,乙酰化黑木耳多糖濃度在0～3 mg·mL-1隨樣品濃度的增加,清除率顯著提高,且一直高于原料的清除能力。當濃度達到3 mg·mL-1時,增長趨勢變緩。

圖10 乙酰化黑木耳多糖清除超氧陰離子自由基的能力Fig.10 Acetylated Auricularia auricula polysaccharide removal of superoxide anion free radical ability

2.7 還原能力

不同濃度樣品的還原能力如圖11所示,不同濃度樣品的還原能力都大于相同濃度下原料多糖,且隨著濃度的增加有所增加,顯示乙酰化可以提高黑木耳多糖的還原能力。

圖11 乙酰化黑木耳多糖的還原能力Fig.11 Acetylated Auricularia auricula polysaccharide of reducing power

3 結論

實驗表明,酰化試劑用量和催化劑NBS添加量對黑木耳多糖乙酰化有顯著影響。通過SPSS軟件對數據進行處理,進一步得到制備乙酰化黑木耳多糖的最優實驗條件為,反應時間為3.5 h,反應溫度為80.0 ℃,乙酰化試劑用量為32.5 mL,NBS添加量為1.0%,在此實驗條件下,得到的乙酰化取代度平均值為0.55。為以后研究乙酰化黑木耳多糖的性質提供了一定的實驗基礎。對乙酰化黑木耳多糖的抗氧化活性研究表明,乙酰化在對黑木耳多糖改性中體現出乙酰化黑木耳具有抗氧化活性。其對清除羥自由基的能力和清除超氧陰離子自由基的能力也有所增加;同時,還原能力也要比原料多糖有所提高。

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Study on the Acetylated polysaccharide preparation and oxidation resistance ofAuriculariaauricular

YANG Chun-yu1,YANG Chun-li2,LIU Hai-ling1,JING Zhi-gang1,XU Xiao-xin3,WANG Tian-hui1

(1.Key Laboratory for Food Science & Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;2.College of Light Industry,Harbin University of Commerce,Harbin 150028,China；3.Heilongjiang Phoenix Bio Technology Co.,Ltd,Harbin 150000,China)

The preparation conditions of acetylatedAuriculariaauricularpolysaccharide were optimized by combination design of quadratic regression orthogonal,and the antioxidant activity were studied at the same time. In this experiment,amide was used as solvent,acetic anhydride was used as acetylated reagent and N-Bromo succinimide(NBS)was used as catalyst. Indicators for acetylated degree of substitution,and the reaction time,reaction temperature,acetylated reagents and NBS addition were used for investigation of variable factors and by quadratic regression orthogonal combination design method. The final data was analyzed by SPSS software. The results showed that reagent dosage of acetylated and NBS addition of polysaccharide fromAuriculariaauricularhad a significant effect(p<0.05)on the acetylated polysaccharide preparation.After equation calculations,the preparation optimal acetylated conditions forAuriculariaauricularpolysaccharide were as:reaction time 3.5 h,reaction temperature 80.0 ℃,acetylating reagent dosage 32.5 mL,NBS addition was 1.0%. Under the experimental conditions,the acetylating of substitution degree average was 0.55. The results of original polysaccharide and acetylating of infrared spectrum detection showed acetylatedAuriculariaauricularpolysaccharide preparation was prepared. Using the optimal conditions for preparation of acetylatedAuriculariaauricularpolysaccharide,the oxidation resistance research showed that the ability of removal hydroxyl free radicals and remove super oxide anion free radical ability were a little improved,and reducing power was also increased

Auriculariauricularpolysaccharide;acetylated;infrared spectrum(IR);oxidation

2015-01-28

楊春瑜(1975-)，女，博士， 教授，研究方向：生物分離純化技術,E-mail：catherineyang88@126.com。

省教育廳青年骨干教師項目(G1155G24)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)23-0105-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.013