Paenibacillus polymyxa ZJ-9混合發酵菊粉和葡萄糖合成 R，R-2，3-丁二醇*

徐尤勇，高健，徐虹，曹燦，黃巍巍

1(南京工業大學食品與輕工學院、材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京，211816)2(鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇鹽城，224051)

2，3-丁二醇是一種重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、食品、燃料及航空航天等領域，具有生物降解性［1－2］。2，3-丁二醇含有2個手性碳原子，因此具有3種旋光異構體(分別為R，R-2，3-丁二醇、S，S-2，3-丁二醇和 meso-2，3-丁二醇)。R，R-2，3-丁二醇除了具有上述用途以外，還是優良的抗凍劑，也是合成手性試劑、手性配體的重要中間體，在手性藥物和天然產物的合成中也有潛在的重要應用［3－4］。研究發現，能夠代謝合成R，R-2，3-丁二醇的微生物寥寥無幾，而多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa，前稱Bacillus polymyxa)是其中唯一具備工業化生產R，R-2，3-丁二醇潛力的微生物［4－5］。P.polymyxa 中的極少數菌株能夠產菊粉酶，可以直接利用能源植物菊芋菊粉(菊糖)一步法發酵制備高附加值的R，R-2，3-丁二醇。菊芋中主要成分為菊粉，占濕重的15% ～20%、干重的80%左右。菊粉是一種生物多糖，它由果糖分子通過β(1→2)鍵連接，聚合程度為2～60，一般平均為10，其終端為葡萄糖單位，故又稱為果聚糖。菊粉經菊粉酶或酸降解可轉化為果寡糖和果糖［6］。

受胞外蛋白水解酶及多種復雜化學物質作用，P.polymyxa分泌的菊粉酶極易失活，導致其在發酵過程中水解菊粉的酶活并不高，并伴隨發酵的進行酶活逐漸下降。分批發酵高濃度的菊芋菊粉制備R，R-2，3-丁二醇時，通過工藝條件優化，依然底物利用率低、殘糖多，產物產量提高收效甚微，嚴重制約了R，R-2，3-丁二醇的工業化發酵制備［7］。改用連續發酵工藝，由于底物濃度等發酵條件受到嚴格限制，菊粉酶活力和菊芋菊粉的利用均獲得了提高，然而底物濃度受限的發酵條件也決定了產物產量甚至比分批發酵低。補料分批發酵是介于分批培養過程與連續培養過程之間的一種過渡培養方式，是指在分批培養過程中，間歇或連續地補加新鮮培養基的培養方法，又稱半連續培養或半連續發酵。補料分批發酵工藝已經被廣泛應用于抗生素、鼠李糖脂、威蘭膠、氨基酸和維生素等產品的發酵生產［8－10］，而 P.polymyxa利用菊芋菊粉和葡萄糖補料分批發酵制備R，R-2，3-丁二醇尚未見相關報道。

一些研究表明，分別利用葡萄糖、純菊粉、果糖和蔗糖等糖類作為碳源時，P.polymyxa發酵制備R，R-2，3-丁二醇效果差，產量均極低，而利用菊芋菊粉粗提液直接作為發酵底物時，產物產量得到大幅度提高。原因分析顯示，菊芋菊粉粗提液中還含有一些微量元素、特殊氨基酸和稀有維生素等成分，這些物質有利于發酵目標產物的合成［11］。因此，理性設計P.polymyxa補料分批發酵制備 R，R-2，3-丁二醇策略，在發酵前期，直接以菊芋菊粉粗提液中的菊粉為初始碳源，在發酵后期添加合適的糖類，特別是葡萄糖，不僅有利于底物碳源的利用，提高底物的轉化率，而且可促進產物R，R-2，3-丁二醇的合成，從而為工業化應用奠定良好的基礎。

在前期研究基礎上［11］，根據 P.polymyx ZJ-9利用菊芋菊粉粗提液一步法發酵制備R，R-2，3-丁二醇的特點，在分批發酵過程中進行補料，分別以葡萄糖、純菊粉、果糖、蔗糖為補料底物，進行發酵效果分析，進而對菊粉和葡萄糖混合發酵工藝條件進行系統深入研究，采用補料分批發酵工藝以期達到提高底物利用率和目標產物R，R-2，3-丁二醇產量的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株以及培養條件

菌株:多粘類芽抱桿菌 (Paenibacillus polymyxa)ZJ-9，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCC No.3044［12］。

活化培養基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，瓊脂10～20，pH 7.0。取冰箱保藏菌株劃線到活化培養基上，置于培養箱內30℃恒溫培養1d。

種子培養基(g/L):菊粉20，蛋白胨10，酵母膏3，NaCl 5，配好的種子液115℃滅菌30 min，置于30℃，200 r/min的搖床中培養22 h至對數生長中后期。

發酵培養基(g/L):菊粉 75，酵母膏 6，蛋白胨2，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO43.09，MnSO4·H2O 0.001，NH4Cl 0.93，FeSO4·7H2O 0.04，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 6.0［11］。

1.2 培養方法

補料分批發酵:補糖濃度500 g/L，分別以3種不同方式補料添加:(1)一次全加，在發酵24 h時添加30 g/L的葡萄糖;(2)恒速流加，在發酵24～40 h時以恒定速度流加30 g/L的葡萄糖;(3)分批補加，分別在24 h，31 h時添加15 g/L的葡萄糖。

搖瓶發酵培養:將上述培養好的種子液按8%的接種量接入裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中培養，30℃ ，120 r/min搖瓶培養44 h。

7.5 L發酵罐培養(BioFlo110，美國 NBS公司):溫度30℃，通氣量1 vvm，裝液量4 L，接種量8%，前22 h轉速為300 r/min，后22 h調為200 r/min，pH調控策略為:發酵初期不控發酵液pH，待發酵過程中隨著pH值降到6.0以下時，用4 mol/L NaOH調pH為6.0。

1.3 菊芋菊粉粗提液制備

新鮮的菊芋洗凈，對半切，沸水浴中煮5 min(滅PPO酶);切絲，75℃于電熱恒溫鼓風干燥箱干燥8 h;干絲用粉碎機粉碎，過40目篩，將得到的粗菊粉于冰箱中保存備用。按照1∶6的比例稱取粗菊粉于水中攪拌后，70℃水浴加熱浸提2 h，冷卻后用 Ca(OH)2調pH置10.0，80℃水浴加熱浸提1 h，用6層紗布，過濾后即可得到菊粉粗提液［13］。

1.4 發酵液細胞干重的測定

取不同時間段的發酵液稀釋25倍于分光光度計660 nm下檢測OD660。取5 mL發酵液于預先稱重的離心管中，8 000 r/min室溫離心10 min，棄去上清液再加人5 mL生理鹽水反復洗滌2次，棄上清液，將沉淀置于80℃的烘箱內烘干至恒重，烘干后的總重量減去離心管重即為細胞干重(Dry Cell Weight，DCW)。以OD660為橫坐標，DCW為縱坐標，作OD660-DCW的標準曲線。

1.5 發酵液總糖的測定

配制100 mg/L的果糖標準液，分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1 mL 的果糖標準液用蒸餾水稀釋到1 mL與4 mL的蒽酮沸水浴反應10 min，流動水冷卻測出OD620，以空白作對照制作標曲。

吸取1 mL待測樣品(將發酵液稀釋1 000倍)，加入4 mL蒽酮試劑，做3個平行;另外吸取1 mL蒸餾水，加入4 mL蒽酮試劑，以此作為對照。將對照和待測樣品沸水浴保溫10 min，取出流動水冷卻至室溫，620 nm測吸光值。再在標曲中查找相應的總糖含量(g/L)。

1.6 發酵液R，R-2，3-丁二醇，乙偶姻產量測定

發酵液R，R-2，3-丁二醇，乙偶姻產量測定采用氣相色譜法檢測，利用面積外標法定量。取1 mL發酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液按1∶1體積比加入乙酸乙酯萃取，靜置分層后取上層清液進行氣相分析。

檢測條件:毛細管色譜柱DB-WAX，30 m×250 μm ×0.5 μm;進樣口溫度210 ℃，進樣量 0.4 μL;分流比20∶1;載氣為高純N2，流速1.2 mL/min;柱溫保持150℃;FID檢測器，檢測器溫度210℃。

1.7 數據處理

2 結果與分析

2.1 菊粉粗提液菊粉濃度對R，R-2，3-丁二醇發酵的影響

以菊芋菊粉粗提液直接作為發酵底物，控制粗提液中菊粉含量分別為 65.0、75.0、85.0、95.0 g/L，其他條件相同，進行發酵培養。檢測分批發酵過程中菊粉消耗、菌體生長和R，R-2，3-丁二醇產量等各參數，并進行比較，結果如表1所示，伴隨初糖濃度的增加，菊粉利用率以及R，R-2，3-丁二醇的生產強度出現下降趨勢，高初糖濃度下(95.0 g/L)最為明顯，說明發酵液中菌體分泌的菊粉酶酶活有限，培養基初糖濃度過高，細胞合成產物的能力相對減弱;另一方面，菊粉濃度的增加雖然對提高R，R-2，3-丁二醇的產量、最大生物量(DCW)有積極作用，但是，發酵液中菊粉殘留量也相應增加，原料利用率呈下降趨勢。由此可見，對于R，R-2，3-丁二醇的發酵生產，分批培養難以實現高產率、高轉化率和高生產強度的統一，因此有必要采用補料分批培養來實現R，R-2，3-丁二醇的高產。

表1 菊粉粗提液不同菊粉濃度下R，R-2，3-BD發酵過程參數Table 1 The process for one-step fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers with different inulin concentration using P.polymyxa ZJ-9 to produce R，R-2，3-BD

實驗中進一步考察了65.0、75.0、85.0和95.0 g/L的菊粉質量濃度對分批發酵過程中細胞比生長速率和產物比合成速率的影響，如圖1所示。在所考察的菊粉濃度范圍內，菌體均能較好的生長，但菊粉濃度過高時，發酵前期細胞的比生長速率和產物的比合成速率都明顯受到抑制，發酵周期相對延長;發酵后期，適當提高糖濃度，有利于產物產量的提高。在發酵前期，菊粉質量濃度為75.0 g/L時，細胞比生長速率，R，R-2，3-丁二醇比合成速率兩者均處于最優水平，同時菌體在此濃度下生長較好，菊粉的利用率也較高，因此在R，R-2，3-丁二醇的補料分批發酵中，將初糖質量濃度選擇在75.0 g/L左右是比較合適的，在發酵后期補加碳源，提高糖濃度，將促進R，R-2，3-丁二醇的合成。

圖1 不同菊粉濃度對細胞比生長速率和產物比合成速率的影響Fig.1 Comparison of kinetic parameters in R，R-2，3-BD batch fermentation by P.polymyxa ZJ-9 under different initial inulin concentration

2.2 補糖種類的確定

前期研究過程中發現，P.polymyxa ZJ-9分批發酵能較好地利用菊芋菊粉粗提液作為發酵底物，而以葡萄糖，純菊粉，果糖，蔗糖等糖類作為碳源時，發酵產物R，R-2，3-丁二醇的產量均很低，分析原因，可能是菊芋菊粉粗提液中一些微量元素、維生素和氨基酸等成分促進了發酵產物的合成［11］。補料分批發酵，前期以菊芋菊粉粗提液作為發酵底物，控制菊粉的初始質量濃度為75.0 g/L左右，在發酵后期分別考察補料添加葡萄糖、純菌粉、果糖和蔗糖對菌體生長和產物合成影響情況。

從圖1可以看出，在發酵后期(發酵22 h后)添加碳源有利于菌體生長和R，R-2，3-丁二醇的合成，因此選擇在發酵22 h(此時菌粉質量濃度已降到約25 g/L)時，分別添加20.0 g/L的葡萄糖、純菊粉、果糖、蔗糖，當碳源濃度再次降到25 g/L時，第二次分別添加20.0 g/L相同的底物。由圖2可知，在7.5 L發酵罐中，P.polymyxa ZJ-9能夠很好利用補加的葡萄糖、菊粉、果糖、蔗糖，與分批發酵相比，通過兩次脈沖補加糖，R，R-2，3-丁二醇的產量得到了提高。其中葡萄糖的利用效果最好，發酵44 h產量達到49.5 g/L，為同批次最高，其次是菊粉、果糖和蔗糖，蔗糖的利用率相對較低，發酵44 h產量僅達到42.8 g/L，殘糖達到17.6 g/L。伴隨發酵進行，P.polymyxa ZJ-9能夠有效地利用上述補料添加的糖類，表明菊芋菊粉粗提液中殘存的微量元素、維生素和氨基酸等成分能夠繼續促進菌株對添加碳源的利用。考慮發酵液最終產物的產量以及葡萄糖成本相對較低，補糖分批發酵選擇補加葡萄糖為研究對象。然而，實驗發現補糖分批發酵在提高產量的同時，最終發酵液中殘糖濃度相對較高，在補加葡萄糖的發酵液中仍然殘留9.4 g/L，因此有必要對混合發酵菊粉和葡萄糖補料分批發酵工藝條件進行進一步改進。

圖2 P.polymyxa ZJ-9發酵合成R，R-2，3-BD的補料分批發酵過程曲線Fig.2 The production of R，R-2，3-BD by P.polymyxa ZJ-9 with Fed-batch fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers using different sugar supplemention

2.3 菊粉和葡萄糖混合發酵工藝條件研究

由上述研究可知，當補加40.0 g/L的葡萄糖時，殘糖質量濃度依然達到約10 g/L，表明補加的葡萄糖過量，最終確定補料分批發酵的過程中添加30.0 g/L葡萄糖。在7.5 L發酵罐中，研究了一次性補加，恒速流加，分批補加三種不同補料方式對P.polymyxa ZJ-9混合發酵菊粉和葡萄糖對合成R，R-2，3-丁二醇的影響，在發酵末期分別測量 DCW，R，R-2，3-丁二醇，乙偶姻，殘糖濃度等情況。圖3可以看出，22 h之前為菌體大量生長階段，22 h以后，為產物大量合成階段，與對照相比，通過后期補糖有利于P.polymyxa ZJ-9對糖的利用率，并促進產物R，R-2，3-丁二醇大量積累。其中分批補加方式(圖3d)，即分別在22 h(此時菌粉質量濃度已降到約25 g/L)和31 h(此時總糖濃度再次降到約25 g/L)分別補加15.0 g/L的葡萄糖，發酵到44 h時，R，R-2，3-丁二醇的產量達到最大值約47.8 g/L，殘糖量少，同時，菌體量相對較高。分析原因，可能一次性補加葡萄糖時，過多的糖抑制了菌體的生長代謝，不利于產物的合成。而恒速流加補糖，發酵周期延長，菌體生長代謝能力低，底物利用效率不高，殘糖多，導致產物R，R-2，3-丁二醇產量偏低。

表2可以看出，補料分批發酵終點與分批發酵相比細胞干重有所提高，其中分批補加方式細胞干重達到22.6 g/L。通過分批補加葡萄糖，R，R-2，3-丁二醇達到了47.8 g/L，與對照相比，糖轉化率由原來的34.9%提高到45.5%，生產強度由原來的0.70 g/(L·h)提高到1.09 g/(L·h)。所以，補料分批發酵對于菌體的生長、產物的合成以及糖轉化率等均具有積極作用。此外，補料分批發酵終點，殘糖濃度相對較低，有利于工業化應用。

圖3 不同的補料方式對發酵合成R，R-2，3-BD的影響Fig.3 Effects of different feeding glucose methods in R，R-2，3-BD production with Fed-batch fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers by P.polymyxa ZJ-9

表2 7.5 L發酵罐中不同補料方式發酵過程參數比較Table 2 Comparison of feeding glucose methods in R，R-2，3-BD production with Fed-batch fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers by P.polymyxa ZJ-9

2.4 25 L發酵罐中補料分批發酵擴大實驗

為了驗證P.polymyxa ZJ-9混合發酵菊粉和葡萄糖制備R，R-2，3-丁二醇發酵工藝條件的可行性，在25 L發酵罐上進行了擴大實驗。如圖4所示，通過補料分批發酵，當發酵44 h時，R，R-2，3-丁二醇產量達到最高值48.5 g/L，而乙偶姻以及殘糖相對較低，分別為 1.34 g/L 和 3.2 g/L，碳源對 R，R-2，3-丁二醇轉化率達到46.2%，從而證明了P.polymyxa ZJ-9混合發酵菊粉和葡萄糖合成R，R-2，3-丁二醇最佳發酵工藝條件的可行性和可操作性，為工業化發酵制備R，R-2，3-丁二醇奠定了堅實的基礎。

3 結論

圖4 25 L發酵罐中補料分批發酵過程Fig.4 The producction of R，R-2，3-BD by P.polymyxa ZJ-9 with Fed-batch fermentation of mixture of inulin and glucose in a 25 L bioreactor

本研究選取菊芋菊粉粗提液直接作為發酵前期底物，考察不同初始菊粉濃度發酵條件下的P.polymyxa ZJ-9 細胞比生長速率(μ)和 R，R-2，3-丁二醇比合成速率(qp)，在此基礎上，分別補料添加葡萄糖、菊粉、果糖和蔗糖進行發酵效果分析比較，確定了補料添加葡萄糖的發酵策略，并在7.5 L發酵罐上進行了分批、補料分批工藝研究。通過上述發酵工藝條件研究，最終確定了P.polymyxa ZJ-9混合發酵菊粉和葡萄糖制備R，R-2，3-丁二醇的最佳工藝條件。研究結果表明，該補料分批發酵工藝具有成本低、效率高和適合工業化生產等優勢。

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