羊水細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)方法比較

肖 婕，張萬興，王 歡，余艷婷，袁金蘭

（吉安市婦幼保健院遺傳室，江西吉安343000）

羊水細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)方法比較

肖 婕，張萬興，王 歡，余艷婷，袁金蘭

（吉安市婦幼保健院遺傳室，江西吉安343000）

羊水細胞培養(yǎng)及染色體核型分析是產前確診染色體疾病診斷的金標準，為妊娠中晚期胎兒臨床診斷提供可靠的科學依據。羊膜腔穿刺是損傷性的取樣技術，對孕婦和胎兒有造成損傷、感染、流產的潛在危險，流產發(fā)生率約0.5%［1］。羊水細胞培養(yǎng)因技術要求高、難度大、周期長、易污染、分裂相少，一旦培養(yǎng)失敗，孕婦難接受第二次穿刺取樣。因此，提高羊水細胞培養(yǎng)成功率是關鍵。本研究就羊水細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種方法比較。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2013年7月－2014年7月我院產前診斷中心對因各種產前診斷指征就診的169名孕婦，孕周16－26不等，行羊膜腔穿刺術取羊水做染色體檢查。

1.2 培養(yǎng)試劑和器材 CO2培養(yǎng)箱，T型培養(yǎng)瓶（CORNING，型號430639），離心機，倒置顯微鏡，購自BioAMF羊水培養(yǎng)基，廣州達暉公司提供40μg／ml的秋水仙堿。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 在B超引導下，經腹穿刺抽取羊水30ml左右，分裝入2支一次性無菌離心管中，盡快送達實驗室接種。

1.3.2 接種 羊水以1 700r／min離心10分鐘。在超凈工作臺內，棄去上清液，保留0.5ml沉淀，加入5ml羊水培養(yǎng)基吹打混勻。將混勻的兩份羊水細胞分別移入兩個T型培養(yǎng)瓶中，靜置于CO2培養(yǎng)箱中，溫度37℃，CO2濃度5%。

1.3.3 細胞原代和傳代培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)6－7天后觀察細胞貼壁及生長情況，此時可見瓶底貼壁細胞已形成克隆。取一瓶做原代培養(yǎng)，直接更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，注意觀察細胞生長情況，適時收獲。另一瓶行傳代培養(yǎng)，棄去原培養(yǎng)液加入新鮮培養(yǎng)液后，用刮刀使瓶壁細胞脫離瓶壁，經吹打混勻后，再次置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，36小時后觀察羊水細胞克隆大小，適時收獲。

1.3.4 細胞收獲 在倒置顯微鏡下觀察羊水克隆大小及數目，適時加入秋水仙堿處理4－5小時后收獲細胞，用檸檬酸鈉與氯化鉀1∶1，低滲12分鐘加入固定液，預固定8分鐘，離心后去上清液，固定30分鐘后離心。重復做二次固定后，原代與傳代培養(yǎng)每份標本分別滴片四張。

1.3.5 烤片和顯帶 置75－80℃烤箱中烤3小時，用胰酶消化4－5分鐘，行Giemsa染色20分鐘。

1.3.6 觀察和計數 每例標本實驗組與對照組均取第2號玻片，由一人閱片一人核對，分別計數核型出現數、可計數數、可分析數。

1.3.7 統計學分析 應用SPSS13.0軟件行t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 羊水細胞生長收獲情況 169例羊水中，原代培養(yǎng)成功162例，成功率95.86%，羊水平均收獲時間為7－8天，同一批羊水常常需要分2—3批次收獲；傳代培養(yǎng)成功率為100%，其中＞20＋6孕周孕婦羊水32例均培養(yǎng)成功。培養(yǎng)時間為8天，收獲時間基本一致，一次即可收獲完成。羊水染色體不同孕周培養(yǎng)成功率見表1。

表1 羊水染色體不同孕周培養(yǎng)成功率

2.2 染色體核型分析情況 兩種方法染色體核型都比較好。原代培養(yǎng)法獲得至少20個可計數型的標本為150例，占已收獲標本總量的92.59%；傳代培養(yǎng)法獲得至少30個可計數核型的標本為152例，另獲得至少20個可計數核型標本為17例，完全可符合WS322.2－2010中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準規(guī)定觀察報告標準數量。具體羊水染色體分裂相出現情況見表2。

表2 羊水染色體分裂相出現結果

3 討論

羊水細胞主要來源于胎兒的皮膚、消化道、呼吸道等處，大部分是衰老和固縮的脫落細胞，這使羊水細胞培養(yǎng)較其他組織如外周血細胞、皮膚細胞的培養(yǎng)更為困難［2］。尤其是孕中晚期隨著孕周的增加羊水細胞雖有增長，但細胞活性低影響培養(yǎng)成功率。通過對比實驗對比，我們發(fā)現：（1）用原代培養(yǎng)較羊水傳代培養(yǎng)步驟更簡單，無需進行傳代，減輕培養(yǎng)期間工作量；不傳代避免因操作造成培養(yǎng)污染；不傳代還避免羊水細胞再貼壁的時間從而縮短羊水報告時間。在羊水克隆較多的情況下，培養(yǎng)成功率很高，便于核型分析。但由于同批羊水，生長情況不同，常常要分2－3批收獲。（2）實驗顯示羊水傳代培養(yǎng)成功率為100%，有足夠的染色體核型便于分析工作。當羊水細胞克隆較少時，進行傳代培養(yǎng)明顯提高了培養(yǎng)成功率。對于大孕周胎兒染色體核型分析，此方法有優(yōu)勢明顯。培養(yǎng)6－7天時，我們可以在倒置顯微鏡下發(fā)現貼壁細胞相互堆集在一起，互相影響不利于生長。我們通過換液后讓羊水細胞脫離瓶壁，重新貼壁更利于生長從而獲得更多更好的分裂相。而且由于細胞再次貼壁時間相同，使得細胞成熟時間基本一致，大大減小了收獲的工作量。（3）在傳代培養(yǎng)中存在部分異常染色體嵌合情況，同一份標本原代培養(yǎng)片中沒有發(fā)現異常。據吳堅柱的文章報道羊水的嵌合體發(fā)生機制中，染色體制片過程中外力作用使染色體發(fā)生斷裂重接、丟失或增加［3］。傳代培養(yǎng)是否增加了假嵌合的風險有待近一步研究。

染色體分析水平的正確性和準確性與否，取決于染色體標本的分裂相數，顯帶的帶紋清晰、豐富、分散效果等問題。制備較高質量的染色體標本防污染是培養(yǎng)的關鍵。技術操作中手法的輕巧是防止丟失的一環(huán)。選擇合適的低滲液、固定液及時間是染色體分散顯帶較豐富的重點。

［1］邊旭明，鄔玲仟，姜玉新.實用產前診斷學［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2008：187－188.

［2］Turhan NO，Eren U，Seckin NC.Second－trimester genetic amnio－centesis：5－year experience［J］.Arch Gynecol Obstet，2005，271（1）：19.

［3］吳堅柱，林少賓，張志強，等.63例羊水嵌合體的臨床分析［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2014，31（4）：523.

2014－08－20）

1007－4287（2015）10－1795－02