一種楊樹銹病病原菌的形態學與分子鑒定

白鵬華等

摘要： 對天津武清區楊樹銹病病原菌進行形態學和分子技術鑒定。結果表明，該菌為落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina），其夏孢子黃色，長橢圓形或矩圓形，大小（29.0～44.0） μm×（11.8～24.8）μm，平均大小35.2 μm×18.4 μm（n=50）；基部刺細密較大，頂部刺稀疏較小；夏孢子萌發可生成多個芽管；rDNA-ITS序列長度為663 bp。

關鍵詞：落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）；夏孢子；形態學觀察；分子鑒定

中圖分類號：S432.4+4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）03-0049-03

Morphological and Molecular Identification of A Poplar Rusts Pathogen

Bai Penghua1，Feng Youren1，Liu Baosheng1*，Zhang Huichao2

（1.Tianjin Institute of Plant Protection，Tianjin 300381，China；

2.Jixian Station of Plant Diseases and Pests Prevention，Tianjin 301900，China）

AbstractBy the methods of morphology and molecule，the poplar rust pathogen in Wuqing district of Tianjin was classified as Melampsora larici-populina. The uredospores were yellow and oblong or rounded rectangle，the size was （29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，mean size was 35.2 um×18.4 μm（n=50）. The thorn on the bottom of the uredospore was bigger and dense，while on the top was smaller and sparse. The uredospore could germinate several tubes；the rDNA-ITS sequence of Melampsora larici-populina was 663bp.

Key wordsMelampsora larici-populina；Uredospore；Morphological observation；Molecule identification

楊樹因其生長迅速、適應性強、品種多樣、分布廣泛且易于繁育等特性，現已成為主要的工業用材樹種之一[1，2]。但大規模集約經營的楊樹人工林易受病害爆發的威脅，其中由柵銹菌屬（Melampsora spp.）引起的葉銹病是楊樹生產中的主要病害，阻礙楊樹產業發展。

銹菌是一種專性寄生性真菌，病菌夏孢子階段，可隨氣流遠距離傳播，侵染時間長，可重復侵染楊樹葉片[3，4]。銹病一般在夏初發生，到8月末9月初就能造成落葉，嚴重時能導致未成熟芽早落，或使樹木易受其它病原物侵染，或易受寒害影響。柵銹菌主要為害葉片，前期夏孢子堆多生葉背面，后期密布葉片，呈黃色粉層，晚秋葉片上出現圓形的棕色至褐色的冬孢子堆[2，5]。本研究旨在通過形態學和分子技術鑒定來自天津武清區的楊樹葉片銹病病菌種類，為楊樹銹病病菌分子鑒定提供技術支持，并為該病害的防治提供參考。

1材料與方法

1.1供試菌

2014年9月，在天津市現代農業科技創新（武清區）基地，采集帶有銹菌夏孢子的新鮮楊樹病葉帶回實驗室，觀察銹病癥狀，備用。

1.2形態學觀察

用滅菌潔凈小毛筆將夏孢子均勻抖落于滴有滅菌蒸餾水的載玻片上，在普通光學顯微鏡下，觀察夏孢子的形態、顏色，測量夏孢子大小。將新鮮的孢子抖落在含有0.1%葡萄糖液滴的載玻片上，放置于20℃溫箱中光照培養，15 h后觀察孢子萌發情況。

1.3分子鑒定

1.3.1夏孢子DNA提取采用Lysis緩沖液提取夏孢子DNA，用滅菌載玻片刮取新鮮夏孢子堆于滅菌研缽中，稱取20 mg孢子堆，置于1.5 mL離心管內（已加入0.65 mL的 Lysis buffer），震蕩30 s再離心2 min（16 875 rcf），將0.5 mL上清液移入新離心管中（內含100 μL乙酸甲緩沖液），將該離心管反復倒置混勻，再離心2 min（16 875 rcf），將0.5 mL上清液移入新離心管中（內含0.5 mL異丙醇），去除上清液加0.75 mL的70%乙醇清洗DNA，離心30 s，去除乙醇，干燥DNA，后將DNA溶解于50 μL水中。

1.3.2rDNA-ITS 序列PCR擴增及擴增產物電泳檢測以夏孢子DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′）和ITS4（5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′）對病原菌的rDNA-ITS序列進行PCR擴增。取PCR產物2 μL，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據條帶亮度粗略估計DNA濃度，同時判別RNA和蛋白質是否除盡。

1.3.3rDNA—ITS序列測序及同源性比對以夏孢子的ITS1和ITS4區擴增產物進行全序列測定[金唯智生物科技（北京）有限公司]，并將獲得的DNA序列在NCBI上進行比對。

2結果與分析

2.1形態學鑒定endprint

夏孢子堆主要生在葉背面，布滿整個葉面，散生或聚生，粉狀，鮮黃色，近圓形；夏孢子黃色，長橢圓形或矩圓形，（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小為35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺細密較大，頂部刺稀疏較小（如圖1-a）。夏孢子萌發可生成多個芽管（圖1-b）。產生有隔菌絲（圖1-c），菌絲分枝（圖1-d），并且在葉面形成白色菌絲層。

2.2夏孢子總DNA提取與rDNA-ITS序列PCR擴增

以所提DNA為模板，ITS1和ITS4為引物進行擴增，可擴增出目標條帶，目標條帶大小為663 bp，見圖2。將rDNA-ITS序列PCR產物進行測序，所得結果在NCBI上進行Blast，結果顯示與Melampsora larici-populina序列同源性為99%。

3結論與討論

柵銹菌屬是楊樹的重要病原菌之一，種類多，種間差異不明顯。傳統的分類方法是根據夏孢子、冬孢子形態及轉主寄主來區分，由于有的菌種沒有或很難發現轉主寄主，有些菌種生活史沒有冬孢子階段，因此，傳統的分類方法有很多不確定因素[7]。本試驗結合銹菌夏孢子形態特征及分子生物學技術，準確鑒定了天津武清區楊樹銹病病原菌種類為落葉松楊柵銹菌（Melamp-sora larici-populina）。其夏孢子黃色，長橢圓形或矩圓形，大小（29.0～44.0）μm×（11.8～24.8）μm，平均大小35.2 μm×18.4 μm（n=50），基部刺細密較大，頂部刺稀疏較小；夏孢子萌發可生成多個芽管；rDNA-ITS序列長度為663 bp。

由于植物病原銹菌很難在培養基上進行人工培養，在實驗室靠寄主擴繁銹菌夏孢子不僅復雜費時，而且收集的夏孢子數量有限，直接影響銹菌分子鑒定能否順利完成。因而，尋找快速簡易提取銹菌總DNA的技術非常重要。本研究采用Lysis緩沖液提取夏孢子DNA，既簡便，又減少了對夏孢子數量的過多依賴，并且成功率高，可直接用于rDNA-ITS序列PCR擴增，可為楊樹銹病的病菌分子鑒定提供了一種快速、高效提取銹菌DNA的方法。

參考文獻：

[1]Hansen E A. Poplar woody biomass yields： a look to the future[J].Biomass and Bioenergy， 1991，1：1-7.

[2]Heilman P E， Ekuan G， Fogle D. Above-and below-ground biomass and fine roots of 4-year-old hybrids of Populus trichocarpa × Populus deltoids and parental species in short-rotation culture[J].Canadian Journal of Forest Research， 1994， 24（ 6） ： 1186-1192.

[3]郝俊貞. 呼和浩特市青楊葉銹病侵染循環和發病規律的研究[J]. 內蒙古林學院學報， 1990（2） ： 20- 27.

[4]景耀， 楊俊秀， 王培新. 楊樹病害[M]. 西安： 陜西科學技術出版社， 1988：34.

[5]周仲銘. 林木病理學 [M].北京：農業出版社，1979：83-87.

[6]余仲東，曹支敏，張星耀.真菌核糖體基因間隔區研究概況[J].西北林學院學報，2000，15（2）：107.

[7]萬志兵，管宏偉，張新葉， 等.楊樹銹菌種和生理小種鑒別方法評述[J].林業科技開發，2012，26（6）：9-12.endprint