肉牛CAST基因5′UTR和3′UTR多態性分析

劉振山等

摘要：

鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）專一抑制鈣蛋白酶（Calpain，CAPN）活性，參與調節牛肉的嫩化及肌內蛋白的水解，其編碼基因是肉質性狀的主要候選基因。本研究根據牛CAST基因5′UTR區（GenBank No. AY834771）和3′UTR區（GenBank No. DQ991097）序列設計兩對引物，用PCR-SSCP方法對魯西黃牛和渤海黑牛共305個樣本進行了單核苷酸多態性分析。結果顯示，CAST基因5′UTR和3′UTR區存在PCR-SSCP多態，在5′UTR區存在6437（C/T）、6477（G/A）和6614（G/T）3個SNP位點，表現為AA、AB、BB、BC和AD 5種基因型；在3′UTR區存在359（T/C）和366（A/G）2個SNP位點，表現為EE、EF、FF和EG 4種基因型。經檢驗表明，魯西黃牛和渤海黑牛均處于非Hardy-Weinberg平衡狀態；群體遺傳多態性分析表明這兩種牛的多態信息含量均為中度多態。

關鍵詞：魯西黃牛；渤海黑牛；CAST基因；5′UTR；3′UTR；單核苷酸多態性

中圖分類號：S823.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）03-0108-05

Polymorphism Analysis on 5′UTR and 3′UTR

of CAST Gene from Beef Cattle

Liu Zhenshan，Liu Guifen，Song Enliang，Liu Xiaomu，Tan Xiuwen，Wan Fachun*

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial

Key Laboratory of Animal Disease Control and Animal Breeding，Jinan 250100，China）

AbstractCalpastatin （CAST） is a protein inhibitor that acts specifically on calpains （CAPN） and plays a regulatory role in postmortem beef tenderization and muscle proteolysis，and its encoding gene was considered to be a main candidate gene for meat quality traits. Based on the published bovine CAST 5′UTR（GenBank No. AY834771）and 3′UTR（GenBank No. DQ991097） sequence， two pairs of primers were designed，and the single nucleotide polymorphisms of the two regions of CAST gene in Luxi（n=160）and Bohai black cattle（n=145）were analyzed by PCR-SSCP technique. The results showed that 3 SNPs at 6437（C/T）、6477（G/A）and 6614（G/T）and 5 genotypes（AA，AB，BB，BC and AD）were detected in CAST 5′UTR， and 2 SNPs at 359（T/C） and 366（A/G） and 4 genotypes（EE，EF，FF and EG）were detected in CAST 3′UTR. A chi-square analysis suggested that the allele frequencies and genotype frequencies of CAST gene were not in Hardy-Weinberg equilibrium， and statistical analysis revealed an intermediate PIC in Luxi and Bohai black cattle.

Key wordsLuxi cattle；Bohai black cattle；CAST gene；5′UTR；3′UTR；SNPs

牛肉嫩度是牛肉食用品質的一個重要感官特征，也是決定肉品質量的主要因素，多年來一直是國內外肉品科學研究的熱點之一。影響肉嫩度的因素很多，包括肌節的長度、結締組織的含量、肌原纖維蛋白的降解程度、畜體的年齡、糖酵解的速度、pH值、可溶性膠原蛋白等。國內外學者對肌原纖維蛋白的降解做了大量研究，發現肉中存在的鈣蛋白酶系統對肌肉在成熟過程中的嫩化起一定的調控作用，是肌原纖維蛋白降解的限速步驟，這引起了科研人員的廣泛關注。

鈣蛋白酶系統在細胞內普遍存在，參與細胞的一系列進程，包括生長、凋亡、遷移和細胞周期等[1]，該系統包括鈣蛋白酶（Calpain，CAPN）、鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）和鈣蛋白酶激活蛋白（Calpain Activator），三者相互作用，通過參與肌原纖維蛋白的降解過程影響肌肉生長及嫩化[2]。

鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）是鈣蛋白酶系統的一個重要成員，是細胞內高效、需Ca2+的內源性專一抑制CAPN活性的蛋白質，它可以識別CAPN與鈣結合引起的構象變化并與之特異性結合，通過抑制CAPN的自溶對其進行抑制調節，從而調節肌肉內蛋白的水解速率[3]。endprint

研究證實，CAST基因是家畜肉質尤其是嫩度性狀的候選基因。對豬CAST基因的研究發現，不同基因型的肌肉除肌內脂肪和背膘厚差異顯著外[4]，其嫩度、屠宰45 min后pH值和滴水損失也存在顯著差異[5，6]；CAST基因對雞肌纖維密度和直徑有著顯著的影響[7]；對牛的研究也發現，CAST不同基因型與該酶的活性、胴體性狀及牛肉剪切值相關[8，9]

魯西黃牛和渤海黑牛是山東省主要的地方黃牛品種，它們具有耐粗飼、抗逆性強、肉質細嫩且蛋白質豐富、遺傳性穩定等優良的生物學特性。本試驗以魯西黃牛和渤海黑牛為研究對象，利用PCR-SSCP方法分析CAST基因單核苷酸多態性（SNP），旨在加快我國地方肉牛肉質改良并為育種工作提供可靠的標記輔助選擇手段。

1材料與方法

1.1試驗材料

以山東地方品種魯西黃牛和渤海黑牛為研究對象，數量分別為160頭和145頭。靜脈采血，血樣EDTA抗凝，置于冰盒，帶回實驗室。

1.2基因組DNA的制備

牛血樣基因組DNA的提取采用常規酚氯仿抽提法[10]，提取后的DNA用TE緩沖液溶解后，經0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定濃度后，-20℃保存備用。

1.3引物合成

試驗所用CAST-5′UTR和CAST-3′UTR引物分別根據CAST基因5′UTR序列（GenBank No. AY834771）和3′UTR序列（GenBank No. DQ991097），應用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設計，由上海博尚生物技術有限公司合成。引物序列、PCR產物大小及退火溫度詳見表1。

1.4PCR擴增反應

PCR擴增體系由7.5 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix （TransGen Biotech Co.， Ltd， Beijing， China）、6.4 μL ddH2O、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、0.1 μL模板DNA（50 ng/μL）組成，共15 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；然后94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s，共35個循環；72℃再延伸10 min，最后4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5PCR-SSCP法檢測單核苷酸多態性

取4 μL PCR產物和8 μL loading buffer [95%去離子甲酰胺、1 mmol EDTA （pH 8.0）、0.025%二甲苯菁、0.025%溴酚藍、10%甘油]，98℃變性10 min，迅速放入碎冰中，冰浴15 min，使之保持單鏈狀態。然后將冰浴的變性混合樣在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=29∶1）中電泳。先進行200 V、10 min的高壓電泳，后120 V電泳15 h，銀染顯色。

1.6測序

經SSCP分析后，挑選特異性較好的呈現多態的PCR產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行純化后測序。

1.7數據統計分析

計算多態位點的等位基因頻率（Allele frequency）、基因型頻率（Genotype frequency）、遺傳純合度（Homozygosity）、遺傳雜合度（Heterozygosity， He）、有效等位基因數（Effective number of alleles， Ne）和多態信息含量（Polymorphism information content， PIC），對位點基因型的分布進行Hardy-Weinberg平衡的卡方適合性檢驗。

2結果與分析

2.1PCR擴增結果

對不同品種的基因組DNA進行PCR擴增，所得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果發現，每對引物的擴增片段與目的片段大小一致，且條帶清晰，特異性好，可直接用于SSCP分析（圖1）。

M：Marker；1、2：不同牛個體

因此，該位點的突變是同義突變。

2.4不同肉牛品種CAST基因型頻率和基因頻率分析

從遺傳學角度統計了CAST基因5′UTR和3′UTR區PCR-SSCP位點的基因型頻率和等位基因頻率（見表2、表3），可以看出，在魯西黃牛和渤海黑牛群體中，CAST-5′UTR以等位基因A、B為主，基因頻率在0.4281～0.5438，CAST-3′UTR以等位基因E、F為主，基因頻率在0.4594～0.5250。適合性χ2檢驗結果表明，魯西黃牛和渤海黑牛均處于非Hardy-Weinberg平衡狀態。

多態信息含量（PIC）和雜合度（He）都是評價群體內遺傳多態性的一個指標，不同品種牛各位點純合度、雜合度、有效等位基因數及多態信息含量分析結果見表4。可以看出，CAST基因在魯西黃牛和渤海黑牛兩個群體中的多態信息含量都處于中度多態，可以作為有效的遺傳標記用于山東地方黃牛遺傳多樣性分析。

3討論

肉品質改良成為當今畜禽遺傳育種界的研究熱點之一。在保持肉牛生長速度的基礎上不斷改善牛肉質量一直是肉牛育種的主要目標，但牛肉性狀的形成是諸多因素參與的復雜過程，并與生長速度存在負相關，目前尚沒有一種切實可行的解決方案。隨著分子生物學技術的發展，利用候選基因策略尋找影響牛肉肉質性狀的主效基因或與其緊密連鎖的分子標記，并將MAS和MAI策略應用于肉質改良，從遺傳基礎上講是可行的，也因此成為研究熱點之一。

鈣蛋白酶蛋白系統是一個高度可調的依賴于鈣離子的蛋白水解酶系統，在細胞內普遍存在，在肌肉組織中，它位于肌纖維Z盤附近和肌質網膜上，控制著肌纖維蛋白的降解，是肌肉蛋白質降解的限速步驟[11]。鈣蛋白酶抑制蛋白在鈣蛋白酶系統中扮演著重要的作用，Pringle等試驗證實，嫩度與鈣蛋白酶抑制蛋白/μ-calpain的活性比值關系顯著，活性比值越大，鈣蛋白酶抑制蛋白的量相對越大，對蛋白酶的抑制作用越強，則肉的嫩度越好[12]。Melody等研究表明，鈣蛋白酶及其抑制蛋白與肌肉發育之間存在著密切關系，鈣蛋白酶抑制蛋白能提高肌肉的嫩度，而肌原纖維又占成熟骨骼肌蛋白重量的50%～60%，所以通過調節鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白的活性可調節肌肉的發育，從而提高家畜的瘦肉率和產出率，提高肌肉的質量[13]。Geesink等研究認為，高水平的鈣蛋白酶抑制蛋白能夠抑制宰后肌肉蛋白的水解和嫩化，而且這種抑制作用是間接性的[14]。endprint

研究發現，CAST基因是影響牛肉嫩度的主要候選基因，定位于7號染色體上[15]，相對位置為117.8 cM[16]，基因全長約為130 kb，包含35個外顯子，其中外顯子2的上游有5個外顯子[17]。CAST基因有4個啟動子，編碼為4個不同的轉錄本，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型，它們主要是在5′端不同。Schenkel等研究發現CAST基因內含子5的一個SNP位點與胴體品質及肉質相關[18]。鄧桂馨等研究也發現CAST基因內含子6的SNP位點與牛肉嫩度顯著相關[19]。

真核生物mRNA的5′UTR和3′UTR區的功能復雜多樣，5′UTR保護mRNA免遭5′端外切酶降解，為mRNA的核輸出提供轉運信號，提高翻譯模板的穩定性和翻譯效率；3′UTR不僅能調控其mRNA的穩定性、控制mRNA的亞細胞定位，而且還在特定氨基酸的編碼過程中起指導作用[20]。研究發現，CAST 5′UTR區的DdeI多態位點和瘤牛及其與黃牛雜交后代的牛肉剪切值（SF）及肌原纖維斷裂指數（MFI）相關[21]；Casas等研究發現CAST 3′UTR區的G/A多態位點與牛肉的嫩度顯著相關[22，23]，可見牛CAST基因5′UTR和3′UTR區對其基因功能起重要的作用。本研究克隆了魯西黃牛和渤海黑牛CAST基因5′UTR及3′UTR序列，并分析了這兩段的多態性，得到5個單核苷酸多態性位點，這些多態位點是否調節CAST基因的表達還需要進一步的研究。

本試驗僅對兩個地方品種牛CAST基因多態性作了初步的探索，需要通過擴大樣本量進一步研究CAST基因的多態性。同時，記錄不同品種、不同個體的肉質性狀，進一步分析基因多態性與生產性能的關系，尋找與肉質性狀QTL相連鎖的標記，通過MAS檢測與標記連鎖的目標基因，進行目的基因型選擇。本研究得到的單核苷酸多態性位點為今后肉牛肉質性狀的研究提供一定的分子基礎。同時，不同肉牛品種中CAST基因多態性位點的分布也為我們進一步揭示遺傳多樣性提供了新的遺傳標記。

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