鴨坦布蘇病毒競爭定量PCR檢測方法的建立與應用

袁朋等

摘要： 在現行PCR檢測鴨坦布蘇病毒（DTMUV）方法的基礎上，設計制備DTMUV競爭模板并以其為定量內標物建立競爭定量PCR（QC-PCR）體系。該體系特異性強、靈敏性高，競爭模板和目標模板可在400個分子/μL的水平上共擴增。臨床應用結果表明，建立的體系能夠滿足簡單快速確定病毒含量的要求。

關鍵詞：鴨坦布蘇病毒；競爭定量PCR；定量檢測

中圖分類號：S858.32文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）03-0113-05

Establishment and Application of Quantitatively

Competitive PCR System for DTMUV Detection

Yuan Peng1，2*， Wang Bin3*， Xu Chuantian1， Yang Shaohua1， Huang Qinghua1， Zhang Xiumei1， Zhang Lin1**

（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of

Animal Diseases Control and Animal Breeding， Jinan 250100， China；2. College of Animal Science and Technology， Shandong Agricultural

University， Taian 271018， China； 3. Department of Bio-Engineering， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China）

AbstractBased on the traditional PCR method for DTMUV detection， the competitive template targeting to DTMUV NS5 gene was designed and used as competitor in the quantitatively competitive PCR （QC-PCR） system with high specificity and sensitivity. The target and competitive templates could be co-amplified at the level of 400 molecules per microliter. The clinical application results indicated that the developed QC-PCR could simply， rapidly and quantitatively diagnose the content of DTMUV.

Key wordsDTMUV；QC-PCR；Quantitative detection

目前我國養鴨業迅速發展，肉鴨、蛋鴨存欄量和鴨肉出口量均居世界首位，但近年來隨著養殖規模的擴大，鴨病的發生也呈上升趨勢，對養鴨業的危害日益嚴重。2010年，一種新型的鴨源黃病毒——鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu Virus， DTMUV）在我國規模化養鴨場爆發并迅速蔓延至全國，給我國養鴨業帶來了巨大的經濟損失[1，2]，據統計，該病僅在2010年造成的經濟損失就達50億元。

DTMUV屬黃病毒科、黃病毒屬，為有囊膜不分節段單股正鏈RNA病毒[3]。鴨感染DTMUV后主要出現神經癥狀、采食量減少、產蛋嚴重下降甚至絕產，并引起大量死亡。同時感染DTMUV的鴨還容易繼發傳染性漿膜炎、大腸桿菌病等其他疾病，且疾病發生后由于大量應用藥物，導致藥物殘留嚴重，影響到鴨肉品質和人類健康。此外，近年來動物流感（H1N1、H7N9、H10N8）相繼爆發，病毒多次感染人類，造成死亡，嚴重危害人類健康，而水禽是流感病毒的重要自然儲存宿主。因此，控制鴨病毒性疾病的流行，不僅能夠減少養鴨業的經濟損失，而且能夠促進鴨產業鏈的健康發展，保障人類健康。

目前尚沒有針對性的治療鴨坦布蘇病毒感染的藥物，亦缺乏有效的疫苗，因此對病毒進行深入研究、開發預防性和治療性藥物勢在必行。但DTMUV活力較差，體外培養穩定性不足[4]，這種特性使得其滴度變化快，相關深入研究困難極大，所以找到一種能夠快速確定病毒含量且操作便捷的檢測方法是后續研究的保證。本研究基于PCR法快速、特異的優點，在現行定性檢測方法的基礎上[5，6]，設計制備DTMUV競爭模板并以其為定量內標物建立競爭定量PCR（Quantitatively Competitive Polymerase Chain Reaction， QC-PCR）檢測體系，用于DTMUV的含量測定，為病毒的深入研究及預防控制提供強有力的手段和技術支持。

1材料與方法

1.1毒株

DTMUV分離株、新城疫病毒La Sota株（Newcastle Disease Virus， NDV）、H9N2亞型禽流感病毒（Avian Influenza Virus， AIV）、禽呼腸孤病毒（Avian Reovirus， ARV）、減蛋綜合癥病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDSV）均由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室分離、鑒定、保存。

1.2試劑和材料

Ex Taq酶、禽源反轉錄酶（AMV）、隨機引物（9 mer）、TRIzol Reagent購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA分子量標準（DNA Marker）購自天根生化科技（北京）有限公司；感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。endprint

1.3試驗方法

1.3.1DTMUV的分離與擴增無菌采集疑似DTMUV感染的病變組織，按常規處理方法制成勻漿，反復凍融3次，8 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清加入雙抗4℃作用4 h，然后經尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，收取尿囊液進行檢測和進一步傳代培養。

1.3.2病毒RNA提取和cDNA第一鏈合成按TRIzol Reagents（Invitrogen）試劑盒操作說明提取病毒總RNA，然后進行反轉錄。反轉錄體系20 μL，總RNA 2 μL，5×Reverse transcriptase buffer 4 μL，dNTP （2.5 mmol/L）8 μL，RNA抑制劑0.5 μL，random primer（9 mer） 50 pmol，AMV 2 μL，DEPC水補足20 μL。反轉錄反應條件為30℃ 10 min，42℃ 1 h，99℃ 5 min，4℃ 10 min，即合成cDNA第一鏈。

1.3.3引物設計與合成參照張琳等[6]建立的巢式PCR檢測DTMUV的方法和Celi等[8]構建競爭模板的原理，設計了3條針對DTMUV NS5基因的引物（表1），分別用于目標模板（Object template， 以下簡稱O）和競爭模板（Competitive template， 以下簡稱C）的擴增，進而用于可定量的競爭PCR反應。其中P1為共用上游引物，P2為擴增O的下游引物，P4為擴增C的下游引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.4目標模板、競爭模板的制備分別以P1/P2、P1/P4為上下游引物進行O和C的擴增，PCR擴增體系為25 μL，其中10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（100 pmol/μL）各0.5 μL，Ex Taq 酶0.5 μL，DTMUV cDNA第一鏈0.5 μL， ddH2O補足25 μL。反應條件為98℃預變性5 min；94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸40 s， 30個循環；再72℃延伸10 min，4℃終止反應。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外觀察拍照后，切膠回收，一部分與T載體連接后進行測序；另一部分則于nanodrop上測定濃度，然后根據片段分子量，精確計算其所含分子數，10倍梯度稀釋制備不同濃度的O和C。

1.3.5QC-PCR檢測體系的建立以P1、P2為上下游引物進行QC-PCR反應，體系25 μL，其中包括10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol） 2 μL，P1和P2（100 pmol/μL）各0.5 μL，Ex Taq酶0.5 μL，病毒目標模板0.5 μL，競爭模板0.5 μL，ddH2O補足25 μL。反應條件為98℃預變性5 min；94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸40 s， 30個循環；再72℃延伸10 min，4℃終止反應。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

1.3.6QC-PCR方法的準確性取10倍系列稀釋的C分別加入不同反應管中，隨后每個反應管中加入同一濃度O進行混合，最后加入QC-PCR反應的其他組分進行共擴增，以驗證建立的體系能否使C和O等量共擴增。

1.3.7QC-PCR方法的特異性分別提取DTMUV、NDV、AIV、ARV的RNA和EDSV的DNA，RNA進行反轉錄得到cDNA第一鏈。隨后分別加入制備的C，用1.3.5中建立的檢測體系進行定性和定量共擴增，以檢測體系的特異性。

1.3.8QC-PCR方法的靈敏性以1.3.4中制備的10倍系列稀釋的O和C為基礎，取相同濃度的兩種模板等量混合，從而得到一些含相同濃度O+C的反應體系。采用建立的方法進行擴增，以確定兩模板可等量擴增的最低濃度。

1.3.9QC-PCR方法的臨床應用對送檢的發病鴨病料進行無菌采集，加入5倍量PBS（pH 7.2）進行研磨制成勻漿，反復凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清按TRIzol Reagents（Invitrogen）試劑盒操作說明提取病毒總RNA，反轉錄后用已建立的競爭定量PCR進行檢測。

2結果與分析

2.1目標模板與競爭模板的獲得

在前期預試驗確定的反應條件下，分別以P1/P2、P1/P4為上下游引物擴增O和C。結果顯示，獲得了兩條約為400 bp和350 bp的特異性條帶，分別與O和C大小相符，且測序結果與參考序列一致。將擴增產物進行回收純化、測定濃度，并計算出每微升分子數分別為4×1013和5.3×1012，將其分別稀釋成4×109個分子/μL的初始濃度后10倍系列稀釋，制備成4×109～4×102個分子/μL的系列O和C備用。

2.2QC-PCR反應的建立

以P1、P2為上下游引物，備用的O和C為反應模板進行競爭定量PCR反應體系的建立。O和C使用相同濃度，經電泳檢測（圖1）顯示，該體系成功擴增353 bp和413 bp的條帶，且亮度相當，引物二聚體幾乎不存在。表明等量模板在建立的競爭體系中可等量高效擴增。

2.3QC-PCR方法的準確性驗證

在準確性驗證試驗中，每個反應由8個子PCR擴增體系組成。在8個反應管中首先分別加入制備的4×109～4×102個分子/μL的系列C各0.5 μL，然后加入同一濃度病毒目標模板，最后加入反應體系的其他組分。在本研究中，選擇濃度為4×107個分子/μL和 4×105個分子/μL的O進行準確性驗證。結果（圖2、圖3）表明，兩個濃度的模板均能夠在建立的QC-PCR體系中與相同濃度的競爭模板等量共擴增，而與其他濃度不能等量共擴增。

2.4QC-PCR方法的特異性endprint

應用建立的QC-PCR反應體系對DTMUV和其他對照病原（NDV、AIV H9N2、ARV、EDSV）在相同條件下進行擴增（體系組成同2.3），以檢驗體系的特異性。結果顯示，對照病原反應組結果相同，僅出現353 bp大小的條帶，而沒有413 bp擴增產物，表明不含有擴增的目的條帶；DTMUV反應組則出現了353 bp和413 bp的條帶，且兩條帶在濃度為4×105個分子/μL時亮度相當（圖4），所以DTMUV的病毒樣品濃度大概為4×105個分子/μL。

2.6QC-PCR對臨床樣品的檢測

提取15份送檢病料的核酸，應用建立的QC-PCR體系進行檢測，其中9份為陽性，且病毒檢測量大致在4×103～4×107個分子/μL之間不等。

3討論

由于DTMUV活力較差，56℃加熱15 min即滅活，即使在37℃的環境中，24 h后病毒滴度下降也非常明顯，所以病毒含量是時刻變化的。基于DTMUV的不穩定特性，在各項研究前進行病毒含量的測定是十分必要的。雖然目前應用于DTMUV的快速診斷方法較多，如RT-PCR[5]、巢式PCR[6]、RT-LAMP、熒光定量PCR、血清學方法[7]等，且檢測效果良好，但這些方法在滿足操作簡單、成本低廉、可定量檢測要求時表現出了極大的局限性：PCR和LAMP反應有很高的敏感性和操作性，但不能夠對擴增產物進行定量；熒光定量PCR能夠定量，但儀器昂貴、成本高；而血清學檢測方法試驗要求較高，操作復雜。本研究建立的QC-PCR，一方面可以代替普通PCR反應進行定性反應，鑒定樣品中是否含有目的核酸；另一方面還可以進行定量反應，將幾個普通的PCR反應進行組合，加入制備的競爭模板即可對樣品進行定量，以滿足對病毒降解狀況的了解。同時，建立的QC-PCR反應體系具有很高的敏感性和特異性。

建立QC-PCR反應體系的關鍵是競爭模板（亦稱競爭子，Competitor）的制備。DTMUV NS5基因在所有片段中保守性最高，且種間差異較大，最適合進行DTMUV的定量檢測體系引物的設計。競爭定量模板構建的方法較多[8～12]，本研究采用Celi等構建競爭模板的原理，針對DTMUV的NS5基因設計了3條引物，成功地擴增得到比目標模板少60 bp的競爭模板。經過準確性和敏感性試驗，證明兩種模板在濃度相同時擴增效率相近，符合QC-PCR的要求。

本研究建立的QC-PCR方法敏感性高、特異性強、成本低廉、操作簡便，重要的是能夠基于DTMUV的特性進行定量檢測，為研究人員明確DTMUV活力狀態、增殖特性及進行后續的深入研究提供了強有力的手段。

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