高效液相色譜法測定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷含量

俞 吉，朱裕林，桑 冉，屈 彪，陳衛東*

0 引言

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨質量受損及骨強度降低，導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病［1］。單味中藥淫羊藿煎服治療絕經后骨質疏松癥在緩解骨痛癥狀、改善骨代謝生化指標、提高松質骨密度等與性激素替代療法比較差異無統計學意義［2-3］。骨疏靈顆粒是安徽中醫藥大學方朝暉教授針對引起老年性骨質疏松癥的“氣虛、陽虛、血淤”的病機，以“益氣、溫陽、活血”為法，用淫羊藿、黃芪、牛膝、牡蠣4味中藥組方，該藥治療骨質疏松癥的作用是多方面的，既能抑制骨的吸收，又能刺激成骨，產生較多骨基質，使骨代謝轉為正態平衡，延緩衰老，是治療骨質疏松的良藥［4-7］。其中淫羊藿為君藥，而淫羊藿苷為淫羊藿的主要活性成分。為進一步完善骨疏靈顆粒的標準，更好地控制該制劑的質量，本文采用高效液相色譜法測定該藥中淫羊藿苷的含量。

1 儀器、試藥與樣品

日本島津1260高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(DAD);Cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);旋轉蒸發儀(金壇市華歐實驗儀器廠);減壓干燥箱(江蘇南京海汪制藥機械裝備有限公司);分析天平(上海市天平儀器廠);超聲波清洗機(上海市聲波儀器廠);抽濾瓶(GB-17);真空泵(SHB-Ⅲ);離心機(LC-4016)。

淫羊藿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110737-200415)，乙腈(色譜純)，水為超純水，甲醇為分析純，其他試劑為分析純。骨疏靈顆粒(安徽中醫藥大學藥學實驗室自制，批號:141001、141002、141003)，淫羊藿、黃芪、牛膝、牡蠣(購自亳州市藥材大市場，經安徽中醫藥大學劉鶴齡教授鑒定均符合中國藥典2010年版規定)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為室溫;流動相:乙腈 －水(3∶7);流速:1 mL/min;紫外檢測波長:270 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密取淫羊藿苷對照品2.5 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成濃度為0.25 mg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 按照發明專利處方配比，取淫羊藿飲片15 g，黃芪飲片20 g，牛膝飲片12 g，牡蠣飲片8 g。淫羊藿與牛膝，以8倍(第1次多加3倍)70%乙醇、回流提取3次，每次2 h;黃芪與牡蠣，以8倍(第1次多加1.5倍)水煎煮2次，每次1 h。將醇提取藥液回收乙醇后與水提取液合并揮干濃縮，在減壓干燥箱以55℃、－0.09～－0.1 Mpa條件下干燥至恒重后取出標記批號。上述操作重復操作 3次，得批號為 141001、141002、141003的骨疏靈顆粒3批。再精密稱取自制骨疏靈顆粒1.0 g，置于50 mL容量瓶中，精密加入稀乙醇定容，密塞，超聲處理20 min，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾過液即得。取淫羊藿藥材粉末按《中國藥典》2010年版記載方法制得淫羊藿藥材溶液備用。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方中除淫羊藿外的其余藥材，按骨疏靈顆粒的工藝制備不含淫羊藿的陰性對照制劑，按照“2.2.2”項下的方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗 精密量取上述對照品溶液、淫羊藿藥材供試品溶液、骨疏靈顆粒供試品溶液及陰性對照溶液注入液相色譜儀中，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，在與對照品色譜圖主峰相同的保留時間上，供試品溶液有對應峰顯示，陰性對照溶液無對應峰。結果表明，陰性溶液對檢測結果無干擾，結果見圖1。

圖1 色譜圖注:A.淫羊藿苷對照品，B.淫羊藿藥材，C.骨疏靈顆粒，D.陰性對照品

2.4 標準曲線的繪制 取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含淫羊藿苷10、50、80、100、200、250 μg 的溶液，分別精密吸取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進樣濃度(mg/mL)為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)，繪制淫羊藿苷的標準曲線，得回歸方程:Y=5×107X+102 087，r=0.999 9。結果表明，淫羊藿苷在0.01～0.25 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。見圖2。

2.5 精密度試驗 取線性關系項下0.01 mg/mL的對照品溶液連續進樣5次，以峰面積計算，平均值為561 724.2，計算精密度，RSD為0.06%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 以對照品溶液中淫羊藿苷的吸收峰面積變化，考察供試品溶液的穩定性。取對照品溶液，分別在 0、2、4、6、8、12 h 測定對照品溶液的峰面積，得RSD為1.6%，結果表明，該成分在12 h內穩定。

圖2 淫羊藿苷標準曲線

2.7 重復性試驗 取同一批骨疏靈顆粒，精密稱取適量(約1 g)，平行操作5份，按“2.2.2”項下供試品溶液的處理方法制備供試品溶液，進樣測定，計算淫羊藿苷的含量，結果RSD為1.8%，表明方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批本品顆粒(批號:141003，淫羊藿苷含量:2.23 mg/g)6份，每份約900 mg，分別置于25 mL容量瓶中，精密加入稀乙醇定容，密塞，超聲處理20 min，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取過濾液分別進樣。再精密加入淫羊藿苷對照品溶液(0.081 mg/mL)1 mL，制備供試品溶液，再次進樣測算峰面積，計算加樣回收率。見表1。

表1 加樣回收率實驗測定結果(n=6)

2.9 含量測定 取3批本品顆粒，每批稱取1.0 g，精密稱定，按照藥材含量處理方法制備樣品溶液，精密量取20 μL注入HPLC色譜儀中，測定峰面積，根據淫羊藿苷標準曲線計算含量，結果批號為141001、141002、141003的骨疏靈顆粒中淫羊藿苷含量分別為2.16、2.24、2.13 mg/g，平均2.17 mg/g。

3 討論

目前，文獻報道中關于淫羊藿苷的含量檢測有紫外分光光度法、導數光譜法、室溫燐光法、薄層掃描法、高效液相色譜法、毛細管膠束電動色譜法［8］，但最為常見的是 HPLC法，后者具有方便、快捷等特點。淫羊藿苷具有可溶解于乙醇、乙酸乙酯的性質，筆者在試驗中曾嘗試使用30%、50%、70%的乙醇分別回流醇提，分別醇提2次、3次、4次，并分別進行含量比較。結果顯示，醇提3次和4次的淫羊藿苷含量明顯較醇提2次高，但醇提3次和4次之間淫羊藿苷含量差異無統計學意義。所以在淫羊藿苷醇提中，選擇70%乙醇回流醇提3次的工藝。

經全波長掃描，淫羊藿苷在270 nm處吸收較大，結果與中國藥典2010版記載一致，因此確定淫羊藿苷的檢測波長為270 nm。在流動相選擇上，有報道乙腈－水有拖尾影響［9］。筆者嘗試使用甲醇－水、甲醇－0.1%冰醇酸、乙腈－3.8%冰醇酸(28∶72)為流動相進行試驗，發現乙腈－水(30∶70)出峰良好，且分離度高，經試驗，陰性樣品對測定無干擾，淫羊藿苷的保留時間約為9 min，保留時間、分離度及淫羊藿苷理論板數均符合實驗要求。綜上所述，本文采用的測定方法簡單易行，結果準確，重現性好，可有效控制該復方制劑的質量。

［1］ 張智海，劉忠厚，李娜，等.中國人骨質疏松癥診斷標準專家共識(第三稿·2014版)［J］.中國骨質疏松雜志，2014，(9):1007-1010.

［2］ 曾炎輝，張澤玫，林永城，等.絕經后骨質疏松癥患者骨代謝生化指標檢測及淫羊藿作用初探［J］.國際醫藥衛生導報，2005，11(6):24-26.

［3］ 趙麗娜.淫羊藿防治骨質疏松臨床效果評價［J］.現代中西醫結合雜志，2003，12(9):922-923.

［4］ 徐曉東，鄭洪新.腎虛與骨質疏松癥［J］.遼寧中醫藥大學學報，2007，9(4):45-46.

［5］ 方朝暉，劉健，章小平，等.骨疏靈改善維甲酸誘導的骨質疏松癥大鼠骨質代謝作用的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2000，6(5):40-42.

［6］ 方朝暉，劉健，章小平，等.骨疏靈對維甲酸誘導的實驗性骨質疏松癥的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2001，8(1):36-37.

［7］ 方朝暉，耿家金，張有志，等.186例老年性骨質疏松癥的中醫證候調查對照研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2004，11(7):614-615.

［8］ 尹志峰，劉敬閃，張蘭桐.淫羊藿苷的含量測定方法［J］.中國醫院藥學雜志，2003，(8):47-49.

［9］ 崔曉紅，袁志芳，張蘭桐.益腎強身片中淫羊藿苷的含量測定［J］.中國新藥雜志，2005，(11):78-80.