miR－133a對惡性黑色素瘤的膜突蛋白表達及侵襲能力的影響

Aparicio Avichacra Carlos Edgar Emilio 王繼綱，2 楊海萍 丁 笛 劉秀萍 許祖德

（1復旦大學基礎醫學院病理學系 上海 200032；2青島大學附屬醫院病理科 青島 266003；3山東省淄博市臨淄區人民醫院病理科 淄博 255400）

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一種常見的皮膚惡性腫瘤，該腫瘤侵襲力強、對放化療不敏感、死亡率高。近年來MM的發病率明顯上升，在西方發達國家其發病率上升速度可能僅次于肺癌[1］。

MM預后不良的主要因素是其高侵襲轉移力[2－3］。早期發現和早期治療是目前臨床上改善MM患者生存率的唯一手段，進一步深入研究MM侵襲轉移機制意義重大。近年來研究表明，FERM蛋白家族成員的膜突蛋白（moesin）與哺乳動物MM細胞浸潤能力相關[4］。TargetScan數據庫的檢索結果提示微小 RNA－133a （microRNA－133a，miR－133a）可能是moesin的調節因子，其靶向結構是其信使 RNA3′－UTR區域[5］。本研究目的是證實miR－133a對人類 MM細胞moesin表達及體外遷移侵襲能力的調節作用，探討miR－133a調控 MM細胞遷移侵襲的可能機制。

材料和方法

實驗材料 SK－mel－28細胞（美國ATCC公司，Cat＃HTB－72），該細胞株具有早期轉移的特點；A375細胞（中國科學院上海細胞庫）的侵襲能力相對較低；正常成人表皮色素細胞（美國ATCC公司，Cat＃PSC－200－013）。lipofectamineTM2000轉染試劑（美國Invitrogen公司，Cat＃11668－027）。miR－133a全長過表達質粒由上海吉凱公司構建。Meosin抗體（美國 Cell Signaling公司，Cat＃3146），Actin（美國 Santa Cruz公司，Cat＃ sc－8432），HRP兔二抗（美國Proteintech公司，Cat＃SA00001－2）。Western blot發光檢測系統購自美國Thermo公司（Cat＃34076）。Prime Script RT Master Mix逆轉錄試劑盒（大連Takara公司，Cat＃DRR036A）。TaqMan?MicroRNA檢測試劑盒（美國ABI公司）。Meosin引物序列為Forward：3′－TGTAAACC－AGAGAGCTGCTGG－5′，

Reverse： 3′－GAAGAGCACACATGAGACAGAGAA－5′，由上海生工公司合成。

細胞培養 SK－mel－28細胞培養于EMEM 培養基，A373培養于DMEM培養基，正常成人表皮色素細胞采用黑素細胞培養試劑盒配制的真皮細胞基底培養基培養。細胞培養時加10%血清，置于37℃、5%CO2培養箱中，達30%～50%匯合度時，根據Lipo2000說明書進行轉染。轉染后24 h提取RNA，48 h收集蛋白進行檢測。進行侵襲遷移實驗時，收集轉染后24 h的細胞進行處理。

Western blot檢測 以細胞裂解液提取總蛋白，首先測定蛋白濃度以保證上樣量相同。SDSPAGE電泳后，65 V恒壓電轉蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗（1∶125）室溫孵育1 h，4℃過夜，TBS緩沖液漂洗后加HRP二抗，室溫孵育1 h后發光系統進行檢測。表達相對定量采用Quantity One軟件。

定量RT－PCR（qRT－PCR）檢測 收集轉染24 h細胞，培養至80%匯合時收集細胞，Trizol提取總RNA后檢測RNA濃度，然后采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成逆轉錄cDNA（上樣量500 ng，37℃15 min），按TaqMan?MicroRNA Assays方案進行PCR反應。反應條件為：95℃預變性30 s，40個循環，95℃20 s，62℃40 s。相對表達率采用2－ΔΔCT法計算。

細胞遷移和侵襲實驗 2D細胞遷移能力檢測采用劃痕法，各組細胞接種于12孔板，待細胞達到100%匯合后用100μL槍頭劃痕，PBS清洗去除劃下的細胞，更換培液后繼續培養6、12、24、48 h后取樣、拍照。

3D細胞侵襲能力檢測采用具有聚碳酸酯微孔濾膜（孔徑8μm）的Transwell小室（Cat＃342）來評定，每孔種植1×105細胞，用200μL無血清培液重懸，下室內置含30%血清的培液作為化學趨化物。培養3、6、9、12 h后取出小室，仔細去除未穿透細胞后結晶紫染色，倒置顯微鏡下計數。

統計學方法 實驗結果采用SPSS13.0統計分析軟件進行分析，每次實驗重復3遍，取其均數表示，采用t檢驗比較各組間相對表達水平差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

miR－133a對MM細胞中moesin表達的影響qRT－PCR結果顯示 MM細胞系中miR－133a的表達量要低于正常色素細胞，其中SK－mel－28細胞尤為明顯，轉染后MM細胞miR－133a的表達明顯增強（圖1A）。

qRT－PCR和Western blot結果顯示兩種MM細胞系中moesin RNA以及蛋白的表達水平要高于正常色素細胞，這種差別在SK－mel－28細胞尤為明顯尤為明顯（圖1B）。而miR－133a轉染后，MM細胞系的moesin RNA和蛋白表達水平有明顯下降，其中SK－mel－28細胞變化更為顯著；兩種MM細胞之間的表達差異也不復存在（圖1C）。

圖1 SK－mel－28和A375細胞中miR－133a對meosin表達水平的影響Fig1 The regulating effect of miR－133aon the expression of meosin in SK－mel－28and A375cell lines

細胞遷移和侵襲能力檢測 劃痕法檢測MM細胞遷移能力結果顯示，MM細胞系SK－mel－28和A375在miR－133a轉染后培養12～48 h的細胞遷移匯合能力較相應對照組均有明顯的下降。Transwell實驗檢測結果同樣顯示，SK－mel－28和A375在miR－133a轉染后培養3～24 h，細胞穿膜能力較相應對照組均有明顯的下降（圖2）。

討 論

圖2 Sk－mel－28和A375細胞轉染miR－133a后的侵襲轉移能力 （×400）Fig2 The migration and infiltration abilities of Sk－mel－28and A375cell lines after miR－133atransfection（×400）

腫瘤轉移是一個多步驟過程，其中腫瘤細胞的運動和遷移能力是主要的影響因素[6］。而細胞的遷移過程中肌動蛋白細胞骨架起著關鍵作用，已知許多內在因素可以調節細胞骨架的聚合和解聚，其中廣受重視的是FERM蛋白家族[7］。FERM蛋白家族已發現有50多個成員。moesin是FERM家族一個成員，相對分子質量為75000，其可以通過調節分子內N端FERM與C末端結構域結合而阻止F－肌動蛋白和膜蛋白的結合。有文獻顯示MM[7］和其他腫瘤[8］細胞中 moesin高表達，頭頸部鱗癌中 moesin高表達其預后差[9－11］，提示 moesin對腫瘤細胞生物學行為的調節具有重要的意義。

本研究采用qRT－PCR和Western blot觀察了兩種不同侵襲能力的MM細胞系中moesin的表達情況，結果發現與正常色素細胞相比，MM細胞中moesin均呈高表達，這不僅表現為基因轉錄的增強，也表現為蛋白表達的增加，這一結果與文獻報道一致[4，10］。而 MM細胞間moesin的表達也有顯著的差異，SK－mel－28的moesin表達量明顯高于A375，這種差異也與兩種細胞侵襲能力的不同一致。上述實驗結果再次提示moesin影響了MM細胞的遷移和侵襲，對moesin進行檢測可以有助于了解MM的生物學行為。

miRNAs是一類19～22個核苷酸構成的非編碼小分子RNA，其在個體發生、分化、凋亡、細胞增生和衰老等多種生物學過程中發揮著重要的作用[13］。miR－133a正常表達于骨骼肌和心肌細胞，許多研究顯示miR－133a重建和高表達對具有抑制腫瘤細胞生長、遷移和侵襲的作用[5，14－16］。TargetScan數據庫檢索顯示miR－133a可能是moesin的調節因子，其靶向結構是信使RNA3′－UTR 區域[5］。

本研究采用miR－133a轉染技術探討miR－133a對MM細胞moesin表達的影響作用，進而探討MM細胞遷移和侵襲的內在機制。結果發現MM細胞miR－133a的表達量較正常色素細胞低，這種現象在 SK－mel－28尤為明顯。轉染 miR－133a 后MM細胞的moesin的基因轉錄和蛋白表達均有明顯下降，這與在食道癌中的研究結果一致[17］。劃痕和Transwell實驗則發現miR－133a轉染后MM細胞隨著moesin表達下降，其體外遷移和侵襲能力也顯著下降。本研究發現miR－133a轉染后兩種MM細胞系間原本存在的moesin表達、遷移和侵襲能力方面的差異不復存在。這些結果強烈提示miR－133a可以下調MM細胞的moesin表達，進而抑制MM細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究的結果證明了miR－133a是moesin的上游調節因子之一，其能夠通過對MM細胞moesin的表達水平進行調節，進而影響MM細胞的生物學行為。進一步深入研究兩者的關系，有助于深入了解MM的發生和轉移機制，對改善MM預后以及新的治療方案的研究具有重要意義。

[1]Rastrelli M，Alaibac M，Stramare R，et al.Melanoma m（zero）：diagnosis and therapy[J］.ISRN Dermatol，2013，2013：616170.

[2]Perlis C，Herlyn M.Recent advancesin melanoma biology[J］.Oncologist，2004，9（2）：182－187.

[3]Chudnovsky Y，Khavari PA，Amy E.Adams Melanoma genetics and the development of rational therapeutics[J］.J Clin Invest，2005，115（4）：813－824.

[4]Estecha A，Sánchez－Martín L，Puig－Kr?ger A，et al.Moesin orchestrates cortical polarity of melanoma tumour cells to initiate 3D invasion[J］.J Cell Sci，2009，122（Pt19）：3492－3501.

[5]Kinoshita T，Nohata N，Fuse M，et al.Tumor suppressive microRNA－133a regulates novel targets： moesin contributes to cancer cell proliferation and invasion in head and neck squamous cell carcinoma[J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，418（2）：378－383.

[6]Geiger TR，Peeper DS.Metastasis mechanisms [J］.Biochim Biophys Acta，2009，1796（2）：293－308.

[7]Lallemand D，Arpin M.Pigment Cell MelanomaMoesin／ezrin：a specific role in cell metastasis？[J］.Pigment Cell Melanoma Res，2010，23（1）：6－7.

[8]Li Q，Gao H，Xu H，et al.Expression of ezrin correlates with malignant phenotype of lung cancer，and in vitro knockdown of ezrin reverses the aggressive biological behavior of lung cancer cells[J］.Tumour Biol，2012，33（5）：1493－1504.

[9]Saito S，Yamamoto H，Mukaisho K，et al.Mechanisms underlying cancer progression caused by ezrin overexpression in tongue squamous cell carcinoma[J］.PLoS One，2013，8（1）：e54881.

[10]Fischer CA，Jung M，Zlobec I，et al.Co－overexpression of p21 and Ki－67 in head and neck squamous cell carcinoma relative to a significantly poor prognosis[J］.Head Neck，2011，33（2）：267－273.

[11]Madan R，Brandwein－Gensler M，Schlecht NF，et al.Differential tissue and subcellular expression of ERM proteins in normal and malignant tissues：cytoplasmic ezrin expression has prognostic significance for head and neck squamous cell carcinoma[J］.Head Neck，2006，28 （11）：1018－1027.

[12]Xie JJ，Xu LY，Xie YM，et al.Roles of ezrin in the growth and invasiveness of esophageal squamous carcinoma cells[J］.Int J Cancer，2009，124（11）：2549－2558.

[13]Nohata N，Hanazawa T，Enokida H，et al.microRNA－1／133a and microRNA－206／133b clusters：dysregulation and functional roles in human cancers[J］.Oncotarget，2012，3（1）：9－21.

[14]Kano M，Seki N，Kikkawa N，et al.MiR－145，miR－133a and miR－133b：tumor－suppressive miRNAs target FSCN1 in esophageal squamous cell carcinoma [J］Int J Cancer，2010，127（12）：2804－2814.

[15]Nohata N，Hanazawa T，Kikkawa N，et al.Caveolin－1 mediates tumor cell migration and invasion and its regulation by miR－133a in head and neck squamous cell carcinoma[J］.Int J Oncol，2011，38 （1）：209－217.

[16]Nohata N，Hanazawa T，Kikkawa N，et al.Identification of novel molecular targets regulated by tumor suppressive miR－1／miR－133a in maxillary sinus squamous cell carcinoma[J］.Int J Oncol，2011，39 （5）：1099－1107.

[17]Sakai NS，Samia－Aly E，Barbera M，et al.A review of the current understanding and clinical utility of miRNAs in esophageal cancer[J］.Semin Cancer Biol，2013，23（6 Pt B）：512－521.