高內涵篩選結合活細胞實時成像技術分析谷氨酸誘導的小鼠神經瘤母細胞N2a凋亡

喬 可 崔士超 胡捷先 陳獻華

（1復旦大學基礎醫學院醫學分子病毒學教育部／衛生部重點實驗室，2醫學神經生物學國家重點實驗室 上海 200032）

谷氨酸是中樞神經系統內一種重要的興奮性神經遞質，在突觸可塑性和介導突觸興奮性活動等方面發揮著重要的作用，對腦內神經元生長發育、分化、遷移、成熟、修復等具有重要的影響［1］。但在病理情況下，過多谷氨酸積聚可導致谷氨酸受體的過度激活引起鈣超載，從而激活神經毒性信號轉導途徑，最后導致細胞凋亡和壞死。目前認為谷氨酸興奮毒性與多種神經元退行性疾病的神經元丟失有關，包括阿爾茨海默病、帕金森綜合征、亨廷頓氏疾病、多發性硬化癥等［2－3］。研究證實，谷氨酸誘導的神經元凋亡模型具有良好的可重復性，可作為研究神經元凋亡的可靠實驗模型［4－5］。因此，建立和評價谷氨酸誘導的神經細胞損傷模型，對研究神經損傷和退行性疾病有重要意義。

高內涵篩選（high－content screening，HCS）分析系統是利用顯微成像及圖像分析技術，在細胞結構和功能完整的條件下，實時快速檢測樣品多維立體的生物效應信息，在單個細胞／亞細胞水平獲取樣品生物學變化的多元化數據，包括單細胞圖像和各項指標、細胞群體的統計分析結果、細胞數量和形態改變、亞細胞結構變化、熒光信號隨時間和空間的變化等［6－7］。該分析系統不僅能夠像傳統流式細胞儀那樣進行群體分析，而且還可以對群體分析中具有特定數值特征的細胞進行形態觀察和數值檢測。神經瘤母細胞N2a是小鼠神經外胚層來源的細胞，因其易于轉染并大量表達微管蛋白等特點，在神經細胞分化、軸突生長及信號通路領域被廣泛應用［8］。

本實驗利用HCS技術，分析不同濃度谷氨酸誘導的N2a細胞凋亡比例；并結合活細胞實時成像技術，跟蹤谷氨酸誘導不同時間下的N2a凋亡的形態學變化特征以及N2a凋亡過程的各項指標，包括凋亡過程中細胞核的凝縮過程以及細胞核碎片化的過程。

材料和方法

儀器和試劑 HCS分析系統（Perkin Elmer Operetta）；Annexin V－FITC／PI試劑盒（BD），Hoechst 33342（Sigma），NucRed Live 647（Life Technologies）；二氧化碳培養箱（Fisher Scientific）。

細胞培養 N2a細胞在含10%胎牛血清（FBS）的MEM培養基（Gibco）中通氣培養（37℃、5%CO2）。每3天以0．05%胰酶消化，按1∶5的比例傳代。

谷氨酸處理細胞 將細胞接種于96孔板，每孔含100μL培養液，培養36 h后每孔加入不同濃度谷氨酸（250、500、750、1 000μg／mL）處理24 h，對照孔不加谷氨酸。

細胞熒光標記 谷氨酸處理24 h后，96孔板每孔100μL細胞培養基中加入1μL Annexin VFITC、1μL PI、1μL Hoechst 33342，輕輕混勻置于37℃、5%CO2培養箱中，孵育30 min后置于HCS系統。細胞凋亡形態實時追蹤選擇谷氨酸濃度750μg／mL處理20 h的N2a細胞，用NucRed Live 647和Annexin V－FITC標記。

圖像獲取、處理和數據分析 分別使用60×、20×、40×物鏡（LWD），每孔選取10個視野分FITC、PI和Hoechst 33342等3個熒光通道拍攝圖片，熒光光源為250 W連續氙燈。恒溫37℃、5%CO2下連續拍攝活細胞實時成像圖片。每隔0．5 h拍攝FITC和NucRed Live 647等2個熒光通道圖片，連續采集記錄6 h Time－lapse圖像，從T0～T12。同時啟動系統遠紅外激光自動對焦功能，防止長時間拍攝過程中焦點的漂移和維持焦平面穩定。

使用HCS系統Operetta中的Columbus軟件來獲取圖像，并對圖像進行參數調整以及生成顯微縮時序列圖，通過Hoechst 33342或NucRed Live 647找到細胞核，分別計算細胞總數、FITC熒光強度和早期凋亡細胞比例、胞核NucRed Live 647熒光染色面積以及熒光強度變異系數（coefficient of variation，CV），CV＝（標準差÷平均值）×100%。對于谷氨酸對N2a細胞凋亡的影響和谷氨酸誘導N2a細胞凋亡的形態學動態追蹤，各重復3次獨立實驗，每孔統計的細胞總數為417～1 176個，使用Excel結合SigmaPlot軟件計算±s并作二維折線圖。組間差異比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

谷氨酸對N2a細胞凋亡的影響 在N2a細胞凋亡的檢測中，Hoechst 33342標記細胞核（藍色），Annexin V－FITC標記胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸（綠色），PI標記胞膜完整性被破壞的凋亡晚期細胞或壞死細胞的胞核（紅色）。于谷氨酸處理24 h后，在細胞培養液中加入上述染色劑，利用HCS技術捕捉和分析細胞凋亡不同階段的特征，并統計不同濃度谷氨酸誘導的N2a細胞發生早期凋亡的比例。

谷氨酸誘導的N2a細胞凋亡在不同階段的特征 谷氨酸處理N2a細胞24 h后，利用HCS技術可以捕捉到細胞凋亡在不同階段的特征。其中，未發生凋亡的細胞僅胞核被Hoechst 33342染色（藍色）（圖1A）；細胞凋亡早期胞核被 Hoechst 33342染色（藍色），胞膜被 AnnexinV－FITC染色（綠色）（圖1B）；細胞凋亡中晚期胞核同時被 Hoechst 33342（藍色）和PI（紅色）染色，胞膜被AnnexinVFITC染色（綠色）（圖1C、D）。

圖1 谷氨酸誘導的N2a細胞凋亡在不同階段的特征圖像（×60）Fig 1 Characteristic images of N2acells at different apoptotic periods induced by glutamate（×60）

不同谷氨酸濃度誘導對N2a細胞早期凋亡比例的影響 隨著谷氨酸誘導濃度的增加，早期凋亡細胞比例逐漸增加。當谷氨酸濃度為750μg／mL時，早期凋亡細胞比例達到峰值42．07%；當谷氨酸濃度為1 000μg／mL時，早期凋亡細胞比例開始減少（圖2、3）。這可能與較高濃度谷氨酸誘導下直接進入壞死狀態的細胞增多以及凋亡晚期進入壞死期細胞的增加有關。統計學分析發現，未加谷氨酸組和加不同濃度谷氨酸組之間數據的差異有統計學意義（P＜0．05）。

圖2 不同濃度谷氨酸誘導下早期凋亡N2a細胞的比例Fig 2 The percentage of early apoptotic N2acells induced by different concentrations of glutamate

圖3 不同濃度谷氨酸誘導下早期凋亡N2a細胞比例的變化（×20）Fig 3 The percentage of early apoptotic N2acells induced by different concentrations of glutamate（×20）

谷氨酸誘導N2a細胞凋亡的形態學動態追蹤選擇可誘導N2a細胞達凋亡峰值的谷氨酸濃度750μg／mL處理N2a細胞20 h作為拍攝起點，利用HCS系統對N2a細胞凋亡的形態學動態變化進行實時追蹤。由于PI染料不適合長時間染色和追蹤細胞凋亡動態，我們采用可進行活細胞染色和成像分析的NucRed Live 647標記細胞核（紅色），同時結合Annexin V－FITC標記發生凋亡細胞的胞膜（綠色）。

結果顯示，隨著拍攝追蹤時間的增加，帶有綠色熒光（Annexin V－FITC）的細胞數目逐漸增多，即發生凋亡的細胞數目增多，而且細胞核逐漸出現碎片化（圖4）。此外，還可以捕捉到同一個細胞發生凋亡的動態過程（圖4中白色三角和箭頭分別標示了兩個細胞的凋亡動態變化）。與之相對應，隨著拍攝追蹤時間的增加，胞核的紅色熒光（NucRed Live 647）強度不均一且熒光強度CV逐漸增大（圖5A），凋亡細胞的胞核面積逐漸縮?。▓D5B）。統計學分析發現，未加谷氨酸組和加不同濃度谷氨酸組之間數據的差異有統計學意義（P＜0．05）。

圖4 谷氨酸誘導N2a細胞凋亡的形態學實時追蹤（×40）Fig 4 The morphological real－time tracking images of apoptotic N2acells induced by glutamate（×40）

圖5 凋亡的N2a細胞的胞核熒光強度CV值（A）及胞核面積（B）隨谷氨酸誘導時間的變化Fig 5 CV of nucleus fluorescence intensity of glutamate induced apoptotic N2acells at different induction time

討 論

有研究報道［9－10］，離體培養的大腦皮層膠質細胞經不同濃度谷氨酸刺激后分別引起細胞的壞死和凋亡，低濃度谷氨酸（1×10－3mol／L）即可誘導膠質細胞發生凋亡，隨著谷氨酸濃度的增高，凋亡細胞數目逐漸增多，但高濃度谷氨酸（1×10－2mol／L）則使膠質細胞的死亡方式以壞死為主。本實驗選取介于兩者之間的濃度250、500、750、1 000μg／mL（1．7～6．8×10－3mol／L）作為谷氨酸的誘導劑量，摸索其誘導N2a細胞凋亡達到峰值的濃度。通過HCS分析結合活細胞實時成像跟蹤拍攝，可以捕捉到谷氨酸誘導后N2a細胞凋亡的形態學動態變化過程，包括從活細胞（Hoechst 33342＋／AnnexinV－／PI－）進入凋亡早期（Hoechst 33342＋／AnnexinV＋／PI－）的胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、細胞核凝縮狀態，進一步進入細胞核碎裂的凋亡晚期（Hoechst 33342＋／AnnexinV＋／PI＋）等各個階段。

HCS分析系統通過全自動高速顯微成像在短時間內生成大量的圖像，全自動圖像分析從這些圖像中提取大量的數據，數據管理軟件負責建檔存儲、注釋比較、檢索分享這些圖像和數據。高內涵分析軟件具有預設解決方案（ready－made solutions），預先安裝常用圖像分析方法和預設數據處理方案，如發現胞核、發現胞質、發現斑點、選擇細胞區域、計算圖像紋理密度特性數據、計算熒光特性數據、計算形態學特性數據等，不僅能獲取大量細胞形態學數據，而且能對其進行有效的管理和分析［11－12］。

HCS分析不僅能夠像傳統流式細胞儀那樣對樣品進行群體分析，而且還可以對群體分析中具有特定數值特征的細胞進行形態學觀察和數值檢測，如對細胞核熒光強度變異系數以及胞核面積大小的改變等形態學指標進行定量檢測。HCS分析結合活細胞實時成像技術可直觀清晰地追蹤拍攝谷氨酸誘導N2a細胞凋亡的形態學變化特征，是一種體外追蹤單一神經細胞凋亡形態學變化的理想方法。該方法也可應用于藥物對細胞凋亡的促進或抑制作用的形態學變化特征的研究。

［1］ Aoyama K，Nakaki T．Neuroprotective properties of the excitatory amino acid carrier 1 （EAAC1）［J］．Amino Acids，2013，45（1）：133－142．

［2］ Cassano T，Serviddio G，Gaetani S，et al．Glutamatergic alterations and mitochondrial impairment in a murine model of Alzheimer disease［J］．Neurobiol Aging，2012，33（6）：1121．e1－e12．

［3］ Cao L，Li L，Zuo Z．N－acetylcysteine reverses existing cognitive impairment and increased oxidative stress in glutamate transporter type 3 deficient mice ［J］．Neuroscience，2012，220（18）：85－89．

［4］ Park SY，Jin ML，Kim YH，et al．Involvement of heme oxygenase－1 in neuroprotection by sanguinarine against glutamate－triggered apoptosis in HT22 neuronal cells［J］．Environ Toxicol Pharmacol，2014，38（3）：701－710．

［5］ 朱加應，張廣云，王建怡，等．雌激素及雌激素受體α減輕谷氨酸對神經細胞的損傷［J］．中國病理生理雜志，2013，30（1）：121－127．

［6］ Christophe T，Ewann F，Jeon HK，et al．High－content imaging of Mycobacterium tuberculosis－infected macrophages：anin vitromodel for tuberculosis drug discovery［J］．Future Med Chem，2010，2（8）：1283－1293．

［7］ Zock JM．Applications of high content screening in life science research ［J］．Comb Chem High Throughput Screen，2009，12（9）：870－876．

［8］ Wang C，Zeng Z，Liu Q，et al．Se－methylselenocysteine inhibits apoptosis induced by clusterin knockdown in neuroblastoma N2a and SH－SY5Y cell lines［J］．Int J Mol Sci，2014，15（11）：21331－21347．

［9］ Yu X，Sun L，Luo X，et al．Investigation of the neuronal death mode induced by glutamate treatment in serum－，antioxidant－free primary cultured cortical neurons［J］．Brain Res Dev Brain Res，2003，145（2）：263－268．

［10］ 王偉，唐榮華，劉洋，等．谷氨酸對大鼠膠質細胞細胞周期和凋亡壞死的影響［J］．中華醫學雜志，2000，80（1）：67－68．

［11］ Anguissola S，Garry D，Salvati A，et al．High content analysis provides mechanistic insights on the pathways of toxicity induced by amine－modified polystyrene nanoparticles［J］．PLoS One，2014，9（9）：e108025．

［12］ Singh S，Carpenter AE，Genovesio A．Increasing the Content of High－Content Screening：An Overview［J］．J Biomol Screen，2014，19（5）：640－650．