（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯類化合物的合成及其IDO抑制活性研究

李銀龍 匡春香 江玉波 楊 青，3

（1復旦大學生命科學學院生物化學系 上海 200438；2同濟大學化學系 上海 200092；3上海市工業菌株工程技術研究中心 上海 200438）

吲哚胺2，3－雙加氧酶（indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO）于1967年首次在兔的腸道中被發現［1］，是肝臟外唯一可催化色氨酸分子中吲哚環氧化裂解，使其沿著犬尿氨酸途徑 （kynureine pathway，KP）分解代謝的限速酶［2］。IDO是一種含有亞鐵血紅素的酶，由403個氨基酸組成［3］，其過度活化被證實與抑郁癥、阿爾茨海默病、白內障、癌癥等疾病的發病機制密切相關［4］。因此，IDO抑制劑作為治療這些疾病的可能手段而備受關注［5］。IDO至今未實現商品化，這給IDO的活性檢測體系的建立帶來了困難。本研究采用基因工程技術表達、純化重組人IDO（rhIDO），并且在此基礎上建立了IDO活性檢測體系，同時開展IDO抑制劑的篩選工作。

盡管國內外有關IDO抑制劑的研究已開展數十年，但目前仍然沒有IDO抑制劑作為藥物上市。以IDO的底物色氨酸為模板進行結構改造，獲得的衍生物1－甲基色氨酸（1－methyl－tryptophan，1－MT）是最早被發現的IDO抑制劑，雖然抑制效率不高（IC50為380μmol／L），但一直是體內外實驗中通用的IDO 抑制劑。在動物實驗中，D－1－MT比L－1－MT能更有效地抑制腫瘤的生長［6］，D－1－MT 于2007年被美國國家癌癥研究所列入RAID（rapid access to intervention development），并進入一期臨床試驗［7］。

本課題組建立了IDO抑制劑活性篩選體系，對大量的具有不同結構骨架的化合物進行活性檢測。本研究合成的（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯類化合物中的β－溴乙烯苯結構具有疏水作用，能夠進入IDO活性口袋，而通過苯酚羧酸酯化反應引入的帶有孤對電子的雜環可以與IDO中血紅素的亞鐵離子配對，從而起到抑制IDO活性的作用。本研究所用原料和溶液均為分析級試劑，未特別處理，目的產物的收率和純度均比較高，其中3個化合物具有中等IDO抑制活性。未來進一步合成這些化合物的結構類似物，并開展IDO抑制劑篩選工作，有望獲得高效的IDO抑制劑，為開發IDO抑制劑類新藥作出開創性的工作。

材料和方法

藥品與試劑 苯、對二甲氨基吡啶（DMAP）、N，N’二環己基碳二亞胺（DCC）、一元羧酸（RCOOH）（阿拉丁試劑公司）；IPTG、1－MT（美國Sigma－Aldrich公 司 ）；BL21（博 大 泰 克 公 司 ）；pET28a－hIDO（本實驗室構建）；氨芐、卡那抗生素（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；5－氨基乙酰丙酸（上海晶純實業有限公司）；L－色氨酸、過氧化氫酶、對二甲氨基苯甲醛、亞甲基藍（日本和光純藥工業株式會社）

儀器與設備 旋轉蒸發儀（上海常豫儀器有限公司）；SCS－24恒溫搖床（江蘇太倉實驗設備廠）；SW－CJ－1FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；GL－20G－Ⅱ離心機（上海安亭科學儀器廠）；超低溫冰箱（美國Thermo scientific公司）

（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚的合成

合成路線［8－9］：

第1步：制備4－羥基苯丙烯酸（化合物b）［10］。在裝有溫度計、回流冷凝管的50 mL三頸瓶中，加入4－羥基苯甲醛（化合物a）0．610 g（5 mmol）、吡啶10 mL、丙二酸1．040 g（10 mmol）、哌啶3滴，溫度升至80℃，采用磁力攪拌使其反應6～8 h，并用TLC跟蹤檢測（正己烷∶乙酸乙酯∶乙酸＝20∶10∶1做展開劑）。結束后冷卻至常溫，用6 mol冷鹽酸中和至pH＝2，采用過濾、冰水及乙酸乙酯洗滌、再用P2O5真空干燥，即得淡黃色粉末0．754 g，即4－羥基苯丙烯酸（化合物b），收率92%。

第2步：制備（E）－3－（4－乙酰氧苯基）丙烯酸（化合物c）［11］。在裝有氯化鈣干燥管的25 mL蛋形瓶中，加入0．820 g（5 mmol）4－羥基苯丙烯酸（化合物b）、三乙胺0．5 mL、乙酐5 mL，在70℃下反應2 h，同時采用TLC跟蹤檢測。結束后加水15 mL，在室溫下攪拌0．5 h，待乙酐完全分解，體系為混濁狀。過濾后濾餅用20 mL水洗3次，采用P2O5真空干燥得淡黃色粉末0．906 g，即（E）－3－（4－乙酰氧苯基）丙烯酸（化合物c），收率88%。

第3步：制備（E）－4－（β－溴乙烯基）乙酸苯酯（化合物d）［12］。在10 mL反應介質（0．5 mL 水和9．5 mL乙腈）中加入（E）－3－（4－乙酰氧苯基）丙烯酸（化合物c）1．030 g（5 mmol）、醋酸鋰0．05 g（5 mmol）、N－溴代丁二酰亞胺0．934 g（5．25 mmol），250 W 微波反應1 min。采用TLC跟蹤檢測，等待反應完全后，用乙酸乙酯200 mL分3次萃取，有機層以無水硫酸鈉干燥，用減壓蒸去乙酸乙酯得1．16 g白色粉末，即（E）－4－（β－溴乙烯基）乙酸苯酯（化合物d），收率96%。

第4步：制備（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚（化合物e）［13］。將含1．21 g（5 mmol）（E）－4－（β－溴乙烯基）乙酸苯酯（化合物d）的20 mL氯仿溶液和10 mL乙醇溶液（含0．68 g乙醇鈉）混合，磁力攪拌，反應3 min。待反應結束后用氯仿100 mL稀釋反應體系，然后加入100 mL2%鹽酸溶液并劇烈攪拌，待靜置后分出水層、有機層，用氯仿50 mL分2次萃取，有機層合并，依次用水洗至中性、然后用無水硫酸鈉干燥，再用減壓蒸去氯仿，即得淡棕色固體（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚（化合物e）0．876 g，收率88%。

（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯化合物的合成

合成線路：

在干燥的圓底燒瓶（25 mL）中加入苯10 mL、（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚199 mg（1 mmol）、RCOOH1．05 mmol、DMAP128 mg（1．05 mmol），室溫條件下磁力攪拌10 min，然后加入DCC206 mg（1 mmol），室溫下反應，采用TLC跟蹤檢測反應進度。反應完成后，采用減壓蒸去溶劑，其殘留物用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5～1∶2為洗脫液進行柱層析分離提純，即得目的化合物C1～C6（表1）。

重組人IDO的表達與純化 重組的表達質粒pET28α－hIDO測序結果正確，將其轉化到BL21感受態細胞中，轉化平板至于37℃恒溫箱中倒置過夜，在轉化平板上挑取單克隆菌落，接種在10 mL含50μg／mL卡那霉素的LB平板中，37℃過夜培養；按1∶50將過夜培養的培養基接種在含50μg／mL卡那霉素的LB中擴大培養，當其D600在0．6左右時，將培養溫度降至30℃并加入人血紅素生物合成中間體α－氨基乙酰丙酸（ALA），培養30 min后，加入異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導，使其終濃度為0．5 mmol／L，30℃誘導表達6 h。4℃下5 400×g離心15 min，收集菌體，用適量含有1 mmol／L的PBS緩沖液重新懸浮菌體，超聲破碎。將超聲破碎后的菌體在4℃下13 800×g離心10 min，收集上清。平衡Ni柱，將上清上到Ni柱上，用含40 mmol／L咪唑的PBS洗脫下其他蛋白，接著用含250 mmol／L咪唑的PBS洗脫下目的蛋白rhIDO，上脫鹽柱，得到純化的rhIDO蛋白質。

表1 （E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯化合物Tab 1 （E）－4－（beta－bromovinyl）phenol ester compounds

體外IDO活性檢測體系的建立 在Littlejohn等［14］研究的基礎上，本實驗室優化并建立了新的體外IDO檢測體系。本研究以1－MT作為陽性對照，驗證檢測體系的可行性以及穩定性。在500μL檢測體系中，將50 mmol／L磷酸鉀緩沖液、400μg／mL過氧化氫酶、40 mmol／L維生素C、20μmol／L亞甲基藍、300 mmol／L L－色氨酸以及待測樣品混合，37℃保溫3～5 min，再向上述混合液內加入IDO，37℃反應30 min后，加入質量濃度為30%的三氯乙酸200μL，終止反應。然后將其在65℃水浴鍋中加熱15 min，13 800×g離心10 min。吸取上清100μL與等體積質量濃度為2%的對二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，加入犬尿氨酸與該溶液產生反應，并使溶液變為黃色，使用酶標儀在492 nm處檢測吸光度（D）值。

IDO抑制活性粗篩 采用上述IDO活性檢測體系，對6個化合物的IDO抑制活性進行粗篩，使用目前體內外實驗中常用的IDO抑制劑1－MT作為陽性對照，所有被檢測物質的濃度均為100 μmol／L，并對其中IDO抑制活性高于1－MT的化合物進行IC50檢測。

化合物IC50的測定 采用上述檢測體系，將初次篩選的具有高效IDO抑制作用的化合物，檢測其在相同底物濃度和酶濃度條件下，不同抑制濃度的下的反應速度，并用常用IDO抑制劑1－MT作為陽性對照，用軟件Origin version 8．0得到其IC50值。

結 果

（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯化合物的表征數據［8－9］

化合物C1：

白色固體；m．p．136．0～137．6 ℃；IR（KBr）：1 724，1 271，1 072，935，746 cm－1；1H－NMR（300 MHz，CDCl3）：δ＝6．77（1H，d，J＝14．0Hz），6．99（1H，d，J＝14．0Hz），7．10～7．20（4H，m），7．35～7．45（4H，m），8．15（2H，d，J＝8．7 Hz）；13C－NMR（75 MHz，CDCl3）：δ＝106．76，110．05，122．07，126．14，127．17，128．74，130．73，133．78，136．17，138．21，140．82，150．68，164．51。

化合物C2：

白色固體；m．p．120．0～121．4 ℃；IR（KBr）：1 724，1 215，1 077，935，777 cm－1；1H－NMR（300 MHz，CDCl3）：δ＝1．90（3H，d，J＝4．5 Hz），5．95（1H，d，J＝15．6 Hz），6．20～6．34（2H，m），6．73（1H，d，J＝14．1 Hz），7．09（3H，d，J＝8．4 Hz），7．31（2H，d，J＝8．4 Hz），7．39～7．48（1H，m）；13CNMR（75 MHz，CDCl3）：δ＝18．74，106．46，117．74，122．03，127．04，129．69，133．44，136．26，140．94，147．16，150．70，165．42。

化合物C3：

淡黃色固體；m．p．124．0～125．3℃；IR（KBr）：1 734，1 271，1 087，935，746 cm－1；1H－NMR（300 MHz，CDCl3）：δ＝6．79（1H，d，J＝14．3 Hz），7．13（1H，d，J＝14．3 Hz），7．20（2H，d，J＝8．3 Hz），7．38（2H，d，J＝8．3 H），7．50（2H，d，J＝5．7 Hz），8．87（2H，d，J＝5．7 Hz）；13C－NMR（75 MHz，CDCl3）：δ＝107．14，121．82，123．17，127．26，134．21，136．00，136．62，150．21，150．78，163．55。

化合物C4：

淡黃色固體；m．p．130．6～132．7℃；IR（KBr）：1 719，935，751 cm－1；1H－NMR（300 MHz，CDCl3）：δ＝6．36～6．37（1H，m），6．75（1H，d，14．4 Hz），7．06～7．18（5H，m），7．35（2H，d，J＝8．4 Hz），9．21～9．25（1H，m）；13C－NMR（75 MHz，CDCl3）：δ＝106．62，110．95，116．98，121．69，122．16，124．21，127．10，133．60，136．22，150．38，159．26。

化合物C5：

白色固體；m．p．100．6～100．8 ℃；IR（KBr）：1 734，930，762 cm－1；1H－NMR（300 MHz，CDCl3）：δ＝6．60～6．61（1H，m），6．76（1H，d，J＝14．1 Hz），7．11（1H，d，J＝14．1 Hz），7．19（2H，d，J＝8．4 Hz），7．34～7．40（3H，q），7．69（1H，s）；13CNMR（75 MHz，CDCl3）：δ＝106．81，112．21，119．61，121．93，127．17，133．89，136．13，143．79，147．25，150．00，156．64。

化合物C6：

黃色固體；m．p．113．7～115．8 ℃；IR（KBr）：1 719，935，767 cm－1；1H－NMR（300 MHz，CDCl3）：δ＝6．77（1H，d，J＝14．3 Hz），7．12（1H，d，J＝14．3 Hz），7．17～7．21（3H，m），7．36（2H，d，J＝8．1 Hz），7．67（1H，q），7．98～7．99（1H，q）；13C－NMR（75 MHz，CDCl3）：δ＝106．78，121．69，127．14，128．08，129．61，132．01，133．70，134．83，136．17，150．38，160．36。

IDO活性檢測體系的建立 本研究檢測了純化的rhIDO的活性，通過酶反應進程曲線和L－犬尿氨酸標準曲線，測得最常用的IDO抑制劑1－MT的IC50為351μmol／L，與文獻報道（IC50380μmol／L）［15］相似，并且具有重復性，因此我們可以確定本研究的IDO活性檢測體系已經成功建立，可用于IDO抑制劑的篩選工作。

IDO抑制活性粗篩 （E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯類化合物C1～C6的IDO抑制活性如圖1所示，化合物C3、C4和C5具有較好的IDO抑制活性，均優于1－MT。

圖1 （E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯化合物IDO抑制活性初篩Fig 1 The preliminary screening of IDO inhibitory abilities of（E）－4－（beta－bromovinyl）phenol ester compounds

表2 活性化合物IC50數據Tab 2 IC50values of active compounds

討 論

IDO參與了多種生理和病理的免疫調節，與人類多種重大疾病密切相關。IDO是色氨酸代謝生成犬尿氨酸途徑的關鍵酶，同時對T細胞有調節作用，主要通過降低色氨酸的低濃度和提高色氨酸的代謝產物，進而直接或間接對T細胞產生影響［16］。同時，IDO與神經系統疾病有緊密的聯系，其中IDO和犬尿氨酸代謝途徑在老年癡呆癥發病過程中起到的重要作用［17－18］；IDO又與腫瘤的發生有著密的聯系，Muller等［19］證明，腫瘤細胞中抑癌基因Binl發生突變失去活性后，會提高STAT1和NF－κB依賴的IDO的表達。

鑒于IDO在免疫調控和多種疾病發生過程中的重要作用，IDO抑制劑作為極具潛力的藥物已引起廣泛關注。現有的IDO抑制劑主要分為：非競爭性抑制劑；反競爭性抑制劑，如海綿Neopetrosia exigua提取物中分離得到的Exiguamine A［20］；競爭性抑制劑，主要通過吲哚環修飾得到［21］，如苯并噻吩衍生物、苯丙呋喃衍生物等。對于IDO抑制劑的研究，除從天然產物中提取分離并開展研究外，人們對化學合成的IDO抑制劑的研究有著更深入的研究。有文獻報道，無論在細胞水平還是在動物水平，色胺酮類化合物均具有高效的IDO抑制活性［22］。但迄今為止尚無藥用的IDO抑制劑，因此篩選新型IDO抑制劑，并研究其體內活性、藥代動力學、治療作用以及不良反應等仍是一個值得探索的領域。

本研究所合成的（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯化合物，反應原料易得，反應條件適中，目標化合物收率較高，且在體外IDO活性檢測體系中證實其中的3個化合物有較好的IDO活性抑制作用，優于常用IDO抑制劑1－MT。這是首次報道β－溴乙烯苯酚酯衍生物具有IDO抑制活性。

綜上所述，本研究合成了（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯新型化合物，確定了其高效的IDO抑制作用，可以考慮其作為藥用IDO抑制劑的前藥進行后續研究，以期為腫瘤以及其他色氨酸代謝異常的疾病的治療提供新的可能。

［1］ Yamamoto S，Hayaishi O．Tryptophan pyrrolase of rabbit intestine．D － and L－tryptophan－cleaving enzyme or enzymes［J］．J Biol Chem，1967，242（22）：5260－5266

［2］ Takikawa O，Yoshida R，Kido R，et al．Tryptophan degradation in mice initiated by indoleamine 2，3－dioxygenase ［J］．J Biol Chem，1986，261 （8）：3648－3653．

［3］ 謝啟超，王玲俐，朱波，等．吲哚胺2，3－雙加氧酶在腫瘤局部免疫耐受中的作用［J］．醫學研究生學報，2008，21（1）：73－75．

［4］ Katz JB，Muller AJ，Prendergast GC．Indoleamine2，3－dioxygenase in T－cell tolerance and tumoral immune escape［J］．Immunol Rev，2008，222：206－221．

［5］ Prendergast GC．Immune escape as a fundamental trait of cancer：focus on IDO ［J］．Oncogene，2008，27（28）：3889－3900．

［6］ Hou DY，Muller AJ，Sharma MD，et al．Inhibition of indoleamine 2，3－dioxygenase in dendritic cells by stereoisomers of 1－methyl－tryptophan correlates with antitumor responses［J］．Cancer Res，2007，67 （2）：792－801

［7］ Muller AJ，Scherle PA．Targeting the mechanisms of tumoral immune tolerance with small－molecule inhibitors［J］．Nat Rev Cancer，2006，6（8）：613－625．

［8］ 江玉波．β－鹵代烯烴衍生物的立體選擇性合成及應用［D］．同濟大學，2008：1－77．

［9］ 匡春香，江玉波．一種（E）－4－（β－溴乙烯基）苯酚酯的制備方法：CN200810038563．4［P］．2008－10－15．

［10］ Goel V．Triton－B adsorbed on flyash：An efficient support for the base catalysed reactions under microwave irradiations［J］．Orient J Chem，2012，28 （4）：1725－1728．

［11］ Kiviranta PH，Leppaenen J，Rinne VM，et al．N－（3－（4－hydroxyphenyl）propenoyl）amino acid tryptamides as SIRT inhibitors ［J］．Bioorg Med Chem Lett，2007，17（9）：2448－2451．

［12］ 于志剛，陳育平，張岐榮，等．DMAP催化合成苯甲酸苯酯的研究［J］．化學試劑，2001，23（2）：110，76．

［13］ Paul WF，Morwena B，Chris B．Novel sulfonamide derivatives as inhibitors of histone deacetylase ［J］．Helvetica Chimica Acta，2005，88（7）：1630－1657．

［14］ Littlejohn TK，Takikawa O，Skylas D，et al．Expression and purification of recombinant human indoleamine 2，3－dioxygenase［J］．Protein Expres Purif，2000，19 （1）：22－29．

［15］ Cady SG，Sono M．1－Methyl－DL－tryptophan，beta－（3－benzofuranyl）－DL－alanine （the oxygen analog of tryptophan），and beta－［3－benzo（b）thienyl］－DL－alanine（the sulfur analog of tryptophan）are competitive inhibitors for indoleamine 2，3－dioxygenase［J］．Arch Biochem Biophys．1991，291（2）：326－333．

［16］ Mellor AL，Munn DH．IDO expression by dendritic cells：tolerance and tryptophan catabolism ［J］．Nat Rev Immunol，2004，4 （10）：762－774．

［17］ Ting K，Brew BJ，Guillemin GJ．Effect of quinolinic acid on human astrocytes morphology and functions：implications in Alzheimer′s disease ［J］．J Neuroinflammation，2009，6：36．

［18］ Rahman A，Ting K，Cullen KM，et al．The excitotoxin quinolinic acid induces tau phosphorylation in human neurons［J］．PLoS ONE，2009，4（7）：e6344．

［19］ Muller AJ，Duhadaway JB，Donover PS，et al．Inhibition of indoleamine 2，3－dioxygenase，an immunoregulatory target of the cancer suppression gene Bin1，potentiates cancer chemotherapy［J］．Nat Med，2005，11（3）：312－319．

［20］ Brastianos HC，Vottero E，Patrick BO，et al．Exiguamine A，an indoleamine－2，3－dioxygenase （IDO）inhibitor isolated from the marine sponge ［J］．J Am Chem Soc，2006，128（50）：16046－16047．

［21］ Muller AJ， Malachowski WP， Prendergast GC．Indoleamine 2，3－dioxygenase in cancer：targeting pathological immune tolerance with small－molecule inhibitors［J］．Expert Opin Ther Targets，2005，9（4）：831－849．

［22］ Yang S，Li X，Hu F，et al．Discovery of tryptanthrin derivatives as potent inhibitors of indoleamine 2，3－dioxygenase with therapeutic activity in lewis lung cancer（LLC）tumor－bearing mice ［J］．J Med Chem，2013，56（21）：8321－8331．