川芎嗪對實驗性肝纖維化大鼠肝組織中細(xì)胞自噬的影響

張海娟 徐軍全 康杰 宋彬妤 王明亮 姚瑞強

·實驗研究·

川芎嗪對實驗性肝纖維化大鼠肝組織中細(xì)胞自噬的影響

張海娟 徐軍全 康杰 宋彬妤 王明亮 姚瑞強

目的 研究川芎嗪對肝纖維化時肝組織中細(xì)胞自噬的影響及其可能的機制。方法 32只健康雄性SD大鼠隨機分為正常對照組10例、肝纖維化模型組11例、川芎嗪治療組11例, 以四氯化碳(CCL4)皮下注射復(fù)制大鼠肝纖維化模型, 川芎嗪治療組在復(fù)制肝纖維化模型過程中同時給予川芎嗪皮下注射， 對照組給予等體積的植物油代替CCl4, 等體積的生理鹽水代替川芎嗪注射液。6周后處死動物, 測定血漿內(nèi)毒素和肝組織羥脯氨酸、丙二醛(MDA)及LC3B蛋白含量, 免疫組織化學(xué)法觀測LC3B蛋白在肝組織中的分布情況。結(jié)果 肝纖維化時肝組織LC3B的含量明顯升高, 主要分布于肝竇周隙細(xì)胞, 且LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值與血漿內(nèi)毒素水平的升高呈正相關(guān)；川芎嗪治療組LC3B表達明顯減弱, 尤其是肝竇周隙細(xì)胞。結(jié)論 川芎嗪的抗肝纖維化作用可能與其降低血漿內(nèi)毒素、肝星狀細(xì)胞(HSC)自噬有關(guān)。

肝纖維化； 內(nèi)毒素；自噬；川芎嗪

細(xì)胞自噬是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)界熱點研究領(lǐng)域之一, 近年來有不少研究報道提示細(xì)胞自噬(autophagy)與肝纖維化之間也存在著密切的關(guān)系［1,2］, 干預(yù)肝組織中的細(xì)胞自噬可能會成為一個新的抗肝纖維化治療靶點。川芎嗪是從活血化瘀類中藥川芎中分離提純的一種生物堿單體, 實驗研究表明川芎嗪具有良好的抗肝纖維化作用［3］, 但其具體作用機制尚不明確。本實驗初步觀察肝纖維化過程中細(xì)胞自噬現(xiàn)象及川芎嗪治療對自噬的影響, 進一步研究川芎嗪抗肝纖維化的機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級健康SD大鼠32只, 平均體重(200±20)g, 購買自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心, 隨機分為正常對照組10例、肝纖維化模型組11例、川芎嗪治療組11例。

1.2 動物模型制備 采用CCl4皮下注射建造大鼠肝纖維化模型, 肝纖維化模型組和川芎嗪治療組首次皮下注射分析純CCl45 ml/kg , 之后按3 ml/kg皮下注射40% CCl4植物油(V/V)混合液, 2次/周, 川芎嗪治療組于造模的同時給予60 mg/kg腹腔注射鹽酸川芎嗪注射液, 6次/周, 正常對照組給予等體積的植物油代替CCl4, 等體積的生理鹽水代替川芎嗪注射液。

1.3 取材 于造模6周時, 乙醚麻醉大鼠, 無菌無熱原技術(shù)條件下腹主動脈采血取血漿, 取肝左葉左半部于4%多聚甲醛中固定, 常規(guī)石蠟包埋4 μm切片；其余部分液于-86℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與方法 兔源LC3B多克隆抗體, 購自美國SIGAM公司(批號L7543), 二抗為羊抗兔抗體, 購自北京中杉金橋有限公司, β-actin一抗及二抗均購自北京中杉金橋有限公司。顯色基質(zhì)偶氮法鱟試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司, 天狼猩紅、固綠購自Sigma公司, MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；鹽酸川芎嗪注射液購自鄭州卓峰制藥有限公司。肝組織膠原染色及羥脯氨酸(HYP)含量測定參照本實驗室以往的方法［3］；血漿內(nèi)毒素及肝組織MDA含量測定依照試劑盒說明書操作；Western Blot測定組織LC3B蛋白的表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC3B免疫組織化學(xué)染色顯示 正常對照組大鼠的肝組織僅有少量的LC3B表達；肝纖維化模型組大鼠肝細(xì)胞胞漿及胞核中LC3B表達陽性顆粒表達顯著增加, 主要分布于肝竇周隙細(xì)胞；川芎嗪治療組較肝纖維化模型組肝細(xì)胞胞漿及胞核中LC3B的陽性顆粒明顯減少, 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 血漿內(nèi)毒素含量及肝損傷、肝纖維化指標(biāo) 肝纖維化模型組血漿內(nèi)毒素及肝組織中HYP、MDA的含量均較正常對照組明顯升高(P＜0.01), 而川芎嗪治療組均明顯降低, 形態(tài)學(xué)觀察與膠原染色也明顯改善。見表1。

2.3 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值的變化 正常對照組LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ的比值最低, 肝纖維化模型組隨著內(nèi)毒素濃度的增加, LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值逐漸增高, 川芎嗪治療組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值較肝纖維化組低, 但仍明顯高于正常對照組(P＜0.05)。見表1。血漿內(nèi)毒素與肝組織LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ表達呈正相關(guān)(r=0.87, P＜0.05)。

表1 各組大鼠血漿內(nèi)毒素(ET)和肝組織HYP、 MDA、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的比較

表1 各組大鼠血漿內(nèi)毒素(ET)和肝組織HYP、 MDA、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的比較

注： 與正常對照組比較,aP＜0.01,bP＜0.05；與肝纖維化模型組比較,cP＜0.01,dP＜0.05

組別例數(shù)ETHYPMDALC3BⅡ/Ⅰ正常對照組100.22±0.040.08±0.15 2.31±0.571.02±0.32肝纖維化模型組11 0.78±0.29a0.35±0.19a14.86±2.11a1.93±0.27川芎嗪治療組11 0.41±0.08b0.19±0.09c4.86±0.95c1.53±0.14d

3 討論

近年來, 肝纖維化的研究日益深入, 許多觀念得到更新,但HSC的活化仍然是公認(rèn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。實驗證明, HSC的活化過程與細(xì)胞自噬的發(fā)生有關(guān), 細(xì)胞自噬可促進HSC的活化, 進而促進肝纖維化［1,2］。細(xì)胞自噬是一種降解細(xì)胞內(nèi)的長壽蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)平衡的代謝過程。LC3B蛋白是常用的細(xì)胞自噬的標(biāo)志分子, 有Ⅰ、Ⅱ型之分,未發(fā)生自噬時, 細(xì)胞內(nèi)合成的LC3B先成為胞漿可溶性的LC3B-Ⅰ；當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時, LC3B-Ⅰ經(jīng)加工修飾與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3B-Ⅱ。其含量與自噬泡數(shù)量成正比, LC3B-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可估計自噬水平的高低。

川芎嗪在治療肝纖維化中取得了較好的效果, 以往認(rèn)為其主要機制和抗脂質(zhì)過氧化、抗肝細(xì)胞損傷有關(guān), 本室最近的研究也表明可能與其降低內(nèi)毒素血癥, 激活肝內(nèi)Nrf2/ARE抗氧化通路有關(guān)［3］。各種急慢性肝臟疾病常伴有腸源性內(nèi)毒素血癥可促進肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展, 但其機制尚不完全清楚。最新資料提示, 內(nèi)毒素可通過TLR4信號通路誘導(dǎo)腹膜腔間皮細(xì)胞自噬［5］, 由此推測內(nèi)毒素也可能通過TLR4信號通路誘導(dǎo)HSC自噬進而促進肝纖維化, 川芎嗪的抗纖維化作用也可能與其降低血漿內(nèi)毒素進而降低HSC自噬有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示, 川芎嗪在抗纖維化、降低血漿內(nèi)毒素的同時,肝組織細(xì)胞自噬也明顯減輕, 而且LC3B-Ⅱ/Ⅰ與血漿內(nèi)毒素水平呈明顯的正相關(guān)。

綜上所述, 川芎嗪的抗肝纖維化作用可能與其降低血漿內(nèi)毒素、肝星狀細(xì)胞自噬現(xiàn)象有關(guān)。進一步的因果關(guān)系及其機制有待下一步的離體細(xì)胞培養(yǎng)實驗證實。

［1］ Song, Y, Zhao, Y, Wang, F.et al.Autophagy in hepatic fibrosis.Biomed Res Int, 2014:436-442.

［2］ Hernandez-Gea, V, Friedman, S L.Autophagy fuels tissue fibrogenesis.Autophagy, 2012, 8(5):849-850.

［3］ 戚紅丹.川芎嗪對大鼠肝纖維化膠原干預(yù)及肝細(xì)胞基因譜影響的研究.北京中醫(yī)藥大學(xué), 2007.

［4］ Puche, J E, Saiman, Y, Friedman, SL.Hepatic stellate cells and liver fibrosis.Compr Physiol, 2013, 3(4):1473-1492.

［5］ Wang, J, Feng, X, Zeng, Y, et al.Lipopolysaccharide (LPS)-induced autophagy is involved in the restriction of Escherichia coli in peritoneal mesothelial cells.BMC Microbiol, 2013(13):255.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.18.191

2015-03-20］

030001 山西醫(yī)科大學(xué)(張海娟)；山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院(徐軍全 康杰 宋彬妤 姚瑞強 王明亮)

徐軍全